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五十多年前,降钙素作为一种从甲状旁腺中分泌出的降血钙性的多肽激素被人们所发现。降钙素是一个由32个氨基酸组成的缩氨酸,在位于1、7位点的半胱氨酸残基及酰胺羟基末端由二硫键连接[1]。降钙素家族包含许多肽类激素,这些肽类激素大都与降钙素在结构上有很多相似性,代表性的的包括:降钙素基因相关肽（CGRP）、和促黑激素（肾上腺髓质素）等多种激素。而其中作为神经系统和免疫系统的交叉分子CGRP,也是骨组织中分布最为广泛的感觉神经肽,在骨形成和骨改建中所扮演的角色越来越受到广泛的关注[2]。大量的实验均已证实CGRP具有良好的生物学活性,尤其可以促进成骨细胞的增殖以及分化,作用在成骨细胞表面受体即:降钙素受体样受体（CRLR）,受体活性修饰蛋白（RAMP1）和受体组分蛋白（RCP）来发挥其生物学作用[3]。本课题组在前期研究中发现,过表达RAMP1后能促进CRLR的膜分布以及CGRP对MG-63细胞促分化作用[4]。为了更加深入的了解CGRP受体功能及受体间关系,本实验在前期工作基础上,首次利用RNA干扰技术探讨干扰RAMP1表达后对CGRP受体及MG-63细胞生物学活性影响的研究,以期更深入的阐明RAMP1的受体功能以及神经肽在骨创伤中的修复机制。CGRP通过G蛋白偶联受体执行其功能。而目前被确认的受体为:降钙素受体样受体（CRLR）,受体活性修饰蛋白（RAMP1）和受体组分蛋白（RCP）。其中CRLR的功能和配型严格的依赖于受体活性修饰蛋白1-3（RAMP1-3）[5]。CRLR与RAMP1联合形成了 CGRP受体。尽管研究的难点依然在试图通过分子模型策略来揭示RAMP1的分子结构特点,但目前RAMP1分子结构乃至功能仍不为人所熟知。为了进一步深入明确RAMP1功能,本项实验通过构建RAMP1真核表达载体,转染MG-63细胞,观察干扰RAMP1的表达后对CRLR、RCP表达量和膜分布的影响,探索干扰RAMP1对CGRP作用于MG-63生物学活性的影响。方法:1.MG63成骨样细胞传代培养:MG63成骨样细胞来自于上海中国科学院细胞库,接种到100ml的培养瓶中常规培养掖中（高糖DMEM含10%FBS）置于5%C02孵箱中,传代备用。2.siRNA的设计和合成:根据Ambion siRNA软件,针对人RAMP1 mRNA靶位通过生物转录方法合成3对siRNA序列,经Blast确定3对siRNA的特异性。确定RAMP 1-homo-185 sense:5c-CAUCACCUCUUCAUGACCATT-3c;antisense:5c-UGGUCAUGAAGAGGUGAUGTT-3c为使用序列,由上海英俊公司合成制作。3.实验分组:体外转录合成法合成及筛选siRNA,转染至传代培养的MG-63细胞分为:RAMP1干扰组、空载体组、空白对照组。4.RAMP1干扰对MG-63成骨样细胞细胞受体的影响:4.1转染RAMP1-siRNA后对CRLR、RCP表达的影响:成功转染RAMP1-siRNA后,荧光定量PCR检测RAMP1干扰组、空载体组、空白对照组CRLR、RCP的相对表达量。4.2对CRLR、RCP在MG63成骨样细胞膜分布表达的影响:激光共聚焦免疫荧光法检测RAMP1干扰组、空载体组、空白对照组CRLR、RCP在MG63细胞膜分布表达情况。5.RAMP1干扰对CGRP促MG63成骨样细胞增殖影响的研究:CCK-8法检测在0、24、48、72、96 h时空白对照组、空载体组、RAMP1干扰组细胞增殖情况。6.RAMP1干扰对CGRP促MG63成骨样细胞分化的影响:Elasa法检测RAMP1干扰组、空载体组、空白对照组ALP活性表达情况;荧光定量PCR检测空载体组、RAMP1干扰组、空白对照组相关成骨标志基因的mRNA表达。7.统计分析:应用SPSS17.0统计软件,所有数据均以x±s表示,P<0.05为具有显著差异。结果:1.siRNA序列的设计与筛选:siRNA的设计和合成:根据Ambion siRNA软件,针对人RAMP1 mRNA靶位通过生物转录方法合成3对siRNA序列,经Blast确定3对siRNA的特异性。用荧光定量PCR法对干扰序列进行筛选,确定最佳干扰效果为使用序列。2.转染RAMP1-siRNA后对CRLR、RCP表达的影响:成功转染RAMP1-siRNA后,荧光定量PCR检测CRLR的结果显示,RAMP1干扰组、空载体组、空白对照组CRLR的相对表达量分别为1.00±0.06;2.05±0.36;2.14±0.18;与其它两组相比,RAMP1干扰组中CRLRmRNA的表达是显著降低的（P<0.05）;而与此同时,RCP的mRNA表达是相对于对照组是明显升高的（P<0.01）。免疫荧光的结果同样显示相对于空载体组,RAMP1干扰组CRLR的绿色荧光是明显减弱的,而RCP的红色荧光是增强的。3.RAMP1干扰对CGRP促MG63成骨样细胞增殖及分化的影响:3.1 CCK-8法测定细胞增殖活性结果显示在稳定转染后的18h后,RAMP1干扰组的细胞增殖效率显著低于与其他两组（p<0.05）18h、24h、36h、48h的测定结果与前面一致,说明当抑制了 RAMP1的表达,CGRP促MG63细胞的增殖效率也会明显受到抑制。3.2RAMP1干扰后并用10-8mol/L CGRP处理诱导MG63细胞3d后,成骨相关标志物的表达变化。荧光定量PCR结果显示RAMP1干扰组ALP、Colla 1、Runx2、OCNmRNA相对表达量分别为1.0±0.12;1.11±0.36;以及0.91±0.17;1.11±0.29;空载体组这些标志物的相对表达量分别为1.74±0.153;1.40±0.10;1.95±0.25;1.27±0.12,RAMP1干扰组ALP、Colla 1、Runx2、OCN的表达均显著低于空载体组（P<0.05）。其中,只有RAMP1干扰组BMP2的mRNA的相对表达量无显著变化。（P>0.05）。3.3 RAMP1干扰后并用10-8 mol/L CGRP处理诱导MG63成骨细胞3d后,Elasa法检测ALP活性表达变化。结果显示,RAMP1干扰组ALP活性为36.66±10.59,空载体组为84.33±15.53;RAMP1干扰组ALP活性也明显低于空载体组（P<0.05）。结论:1.RAMP1干扰减少了 CRLR蛋白在MG-63成骨样细胞膜上的表达但同时增加了RCP在膜上的分布。2.RAMP1干扰会抑制CGRP促进MG-63成骨样细胞增殖的效果。3.RAMP1干扰后会抑制CGRP刺激的相关成骨相关标志物的表达,但其中BMP2的表达没有被明显抑制。同时RAMP1干扰后也会抑制CGRP刺激的MG63细胞ALP活性的表达。