论文部分内容阅读
由于中华鳖（Pelodiscus sinensis）集约化养殖的不断发展,导致其养殖环境不断恶化、疾病频发,严重制约了中华鳖养殖产业的可持续发展。为了揭示中华鳖抗病分子机制,本研究利用Illumina HiSeqTM 2500高通量测序平台对感染嗜水气单胞菌的中华鳖脾脏组织进行转录组测序,并根据转录组测序结果,选取中华鳖免疫关键基因MHCⅡα及MMR1-LIKE-LIKE进行RACE克隆,同时对两个免疫基因进行生物学、组织表达及免疫应答分析。本论文研究结果可概括如下:1.转录组测序及免疫相关基因筛选转录组测序共获得48 884条Unigenes,将Unigene与COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、eggNOG和NR数据库进行比对,共获得17 202条注释信息。生物信息学分析结果显示共有2 300条Unigenes表达差异显著,其中上调899条、下调1 401条。对差异基因进行KEGG通路富集分析,结果显示显著富集的前20个通路中有3条免疫相关通路（Intestinal immune network for Ig A production pathway,Hematopoietic cell lineage pathway和Fc gamma R-mediated phagocytosis pathway）。根据KEGG和GO注释信息,共筛选得到36个差异表达的免疫相关基因,按功能将其分为8类:Antigen processing and presentation、Innate immune molecules、T/B cell activation and proliferation、Toll-like receptor signaling pathway、Cell adhesion、immunity signaling molecule、Complement activation和Chemokines and chemokine receptors。最后,从免疫相关基因中随机挑选18个基因进行qRT-PCR验证,结果显示变化趋势与转录组测序分析结果基本一致,说明转录组数据结果真实可靠。2.MHCⅡα及MMR1-LIKE-LIKE基因的cDNA全长克隆表达及免疫应答研究为了探究中华鳖的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）的结构和功能,本研究利用RACE技术成功克隆获得中华鳖MHCⅡα基因的cDNA全长序列,序列长度为1 296 bp,其开放阅读框（ORF）为807 bp,总共编码268个氨基酸,分为信号肽序列,II类组织相容性抗原α结构域,IGc1结构域及跨膜结构域4个功能结构域。通过NJ法构建的系统进化树分析显示中华鳖与西部锦龟（Chrysemys picta bellii）亲缘较近,而与哺乳类、鸟类及鱼类亲缘关系较远。荧光定量PCR结果分析表明MHCⅡαmRNA在中华鳖8个组织中均有表达,在脾、心、肝及肠组织中表达水平较高,在肌肉组织中表达量最低。感染嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）12h后,中华鳖MHCⅡαmRNA在肝和肠组织中显著上调表达;感染1天时在脾组织中显著上调表达;感染1天及5天时在肾组织中显著上调表达,以上研究表明中华鳖MHCⅡα基因参与了中华鳖免疫反应。MR能辅助巨噬细胞吞噬并加工糖蛋白,并呈递给MHC-Ⅱ类分子,为了探索中华鳖甘露糖受体（mannose receptor,MR）的结构和功能,本研究利用RACE技术成功克隆得到中华鳖MMR1-LIKE基因的cDNA全长序列,其长度为1 416bp,该基因开放阅读框（ORF）1 137bp,一共编码378个氨基酸,分为低复杂区域,跨膜结构域,蓖麻毒素型β三叶草的结构域以及C型凝集素结构域。通过NJ法构建的系统进化树分析发现中华鳖与三趾箱龟（Terrapene carolina triunguis）、西部锦龟（Chrysemys picta bellii）及绿海龟（Chelonia mydas）亲缘关系较近,而与哺乳类、禽类及鱼类亲缘关系较远。荧光定量PCR结果分析表明MMR1-LIKE mRNA在中华鳖8个组织中均有表达,在肝脏中表达水平较高,在肠道及胃中表达量最低。感染嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）后,肝脏、脾脏、肠道及肾组织中MMR1-LIKE mRNA相对表达量在一定的时间点均出现显著上调,以上研究表明中华鳖MMR1-LIKE基因在嗜水气单胞菌的免疫应答中起着重要作用。