鸽腺病毒病是一种由禽腺病毒引起的厌食、呕吐、腹泻、肝脏损伤为主要特征的病毒性传染病。近年来流行范围加大,且有报道出新的腺病毒变异株,因此对鸽腺病毒病的诊断与防控带来一定风险。2021年,南京六合区、溧水区鸽场内鸽群发生疑似鸽腺病毒病感染病例,患病鸽主要集中在1月龄的幼鸽。通过鸽场采样和实验室研究,确定鸽腺病毒是主要病原,且检测到新型鸽腺病毒的流行。随后对新型鸽腺病毒六邻体蛋白（Hexon）进行了研究,包括Hexon蛋白的克隆与原核表达以及单克隆抗体的制备,为以后有效疫苗的研发做好铺垫。本试验包括以下四个部分:试验一 南京地区PiAdV感染情况的流行病学调查对发病鸽场的发病鸽及同群鸽进行采样,采集咽拭子和肝脏样品共计248份。设计了 2对引物,建立能同时检测鸽腺病毒Ⅱ型和新型鸽腺病毒的PCR方法,对采集的临床样品进行检测,纯化Hexon基因,进行克隆测序,并运用DNAStar软件进行生物信息学分析。结果显示:鸽腺病毒的检出率为15.7%,其中鸽腺病毒Ⅱ型占71.8%,新型鸽腺病毒占28.2%。检出的鸽腺病毒主要为1月龄以内的幼鸽,检出率达阳性总数的40%。对病变组织进行病理切片的观察发现有典型的嗜碱性包涵体。对临床样品也同时检测了鸽圆环病毒与鸽疱疹病毒的感染情况,两种病毒检出率分别为19.7%和8.4%。以上结果表明南京地区鸽腺病毒感染率高,病原类型不再单一而是呈有混合感染趋势,且病原出现明显的变异。试验二 新型鸽腺病毒Hexon蛋白的克隆与原核表达为了探究新型鸽腺病毒主要结构蛋白Hexon的免疫学特性,参考新型鸽腺病毒Hexon基因序列,用DNAstar等软件分析其亲水性、抗原性、抗原表位,截取了抗原决定簇较为丰富的一段序列。设计出一对特异性引物,PCR扩增部分Hexon序列,得到大小约为1038bp的单一产物。将部分Hexon基因克隆到pET-32a载体上,成功构建出pET32a-Hexon重组质粒。重组质粒转化至BL21感受态细胞后,经IPTG诱导即可表达出重组蛋白。经SDS-PAGE电泳鉴定,可得到一条约为57kDa大小的条带,符合预期大小,且蛋白以包涵体形式表达。重组蛋白纯化后,SDS-PAGE电泳显示仅存在57kDa左右的条带,表明蛋白表达正确,成功建立起原核表达系统。试验三 新型鸽腺病毒Hexon蛋白单克隆抗体的制备进一步研制了新型鸽腺病毒的单克隆抗体。将纯化后的重组蛋白作为免疫原,与佐剂乳化后接种6-8周龄雌性Balb/c小鼠。三免后,测定血清抗体水平,选取达到阳性标准的小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合。使用单克隆抗体技术制备了得到1株能稳定分泌抗Hexon蛋白的单克隆抗体2B3。通过单抗亚型鉴定试验得知单抗2B3为IgG1亚型,λ轻链。免疫组化试验表明单抗2B3可以与新型鸽腺病毒Hexon蛋白结合,且蛋白表达在细胞质中。将杂交瘤细胞2B3腹腔注射至8周龄雌性Balb/c小鼠,一周后可以采集到效价极高的小鼠腹水,通过ELISA试验鉴定小鼠腹水效价可达1:204800。试验四 抗Hexon蛋白单克隆抗体的表位鉴定探究了新型鸽腺病毒的单克隆抗体2B3的抗原表位。利用原核表达的截短Hexon蛋白作为抗原,单抗2B3作为一抗进行Western blot分析,进行抗原表位鉴定。初步定位后,再使用同样的方法精确定位到结合的抗原区域,最终筛选到抗原识别表位为386SGVPQG391。比较单抗抗原表位的同源性,结果表明单抗2B3的抗原表位保守性差,仅能与新型鸽腺病毒结合,不与其他类型腺病毒结合。综上所述,本研究建立起能同时检测鸽腺病毒Ⅱ型和新型鸽腺病毒的PCR检测方法,结果表明鸽腺病毒在南京地区存在普遍流行,并呈不断变异的趋势,且与其他病原存在混合感染。针对新型鸽腺病毒的Hexon序列,成功建立起原核表达系统,随后制备出抗Hexon基因的单克隆抗体且鉴定出对应的抗原表位,这为后续建立起血清学诊断方法打下良好的基础。