目的 聚乙二醇(PEG)修饰蛋白质药物,改变了药物分子的物理和化学性质,包括构造,静电结合特性,疏水性等,屏蔽了药物本身的抗原决定簇,从而提高了药物的药代动力学特性,但是也带来了一些不容忽视的弊端。研究表明PEG修饰后的蛋白类药物能诱导细胞内产生功能未知的空泡。为此,本文以PEG修饰的重组尿酸氧化酶(rUOX)作为研究对象,通过PEG多点修饰rUOX,体外观测药物作用后的细胞形成空泡的状况,分别探究不同类型细胞形成空泡的不同情形,为研究PEG空泡的产生机制提供事实依据。方法①制备BL-21大肠杆菌感受态细胞,应用质粒转化法筛选菌种,通过SDS-PAGE电泳检测rUOX蛋白表达量,菌种发酵诱导表达以获得rUOX。②超声破碎菌体,酶切融合蛋白并应用不同层析方法纯化得到目的蛋白。③分别应用相对分子质量为5K和20K,活化集团为单甲氧基琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)的PEG修饰剂(反应条件为:pH9.0,4℃,rUOX 分别与 mPEG5k-SPA和mPEG20k-SPA 的质量比为 1:10 和 1:40,反应2.0h)对rUOX进行修饰,以期获得稳定性较好,纯度较高的PEG-rUOX。④离体培养人主动脉内皮细胞系(HAEC)、293人胚肾细胞株(293细胞)以及仓鼠卵巢细胞亚株(CHO-K1),应用分子量为5kD和20kD的PEG及其修饰的rUOX分别给药于上述细胞。观察细胞产生空泡的现象并对其进行评分,应用ELISA检测PEG或PEG修饰的药物是否进入细胞内。结果①含有pET32a(+)表达质粒的rUOX菌株经转化筛选后,目的蛋白表达量在30%左右;②rUOX菌体经超声破碎后主要以可溶性蛋白的形式存在于破菌上清中,酶切分离纯化目的蛋白后,SDS-PAGE电泳检测显示蛋白纯度达到95%左右;③PEG修饰后的产物经过凝胶过滤层析,去除PEG残留后,电泳检测显示PEG残留基本去除且修饰后的蛋白活性均保留了 26%以上。④活化前后的PEG20k和PEG5k均导致了 293细胞产生了大面积空泡,ELISA显示PEG进入该细胞内;其他组无明显差异。结论 这种体外空泡的产生局限于不同类型的细胞,与PEG分子本身有关,可能与所耦合的蛋白药物无关,且活化前后的PEG均能在体外培养的条件下使得293细胞产生这种空泡,而就目前的实验现象来看,PEG20k和PEG5k修饰的rUOX并未使得实验中的细胞产生空泡。