研究背景及目的胃癌（gastric cancer,GC）是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一。据最新数据统计,2012年全球新发GC约951000例,占所有肿瘤新发病例的6.8%,而GC病死人数为723000人,占所有肿瘤病死人数的8.8%,GC的发病率和病死率在所有恶性肿瘤中分别排第五位和第三位。另外,每年超过70%的胃癌新发病例出现在发展中国家,特别是中国。由于我国胃癌的发病率和病死率较高、恶性程度大、临床治疗效果不佳,严重影响国人生命健康。目前,化疗是胃癌的主要治疗措施之一,而5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）等常用化疗药物毒副作用大、不良反应发生率和耐药率高。因此,寻找天然、低毒和高效的药物治疗胃癌意义重大。陈皮素（Hesperetin）是从桔子和葡萄柚等芸香科柑橘属植物果实皮中提取的一种二氢黄酮苷,以糖苷形式存在于自然界中,进入人体消化系统后在肠道细菌和酶的作用下发生去糖基化形成Hesperetin,经肠道吸收进入血液循环。作为一种天然植物单体,Hesperetin可调控PI3K/Akt、NF-κB、Notch及Keap/Nrf2等细胞信号转导通路而发挥抗炎、抗菌、抗肿瘤、抑制肝脏纤维化和免疫调节等多种生物学功能。为了明确Hesperetin对胃癌细胞增殖凋亡的作用,并探讨其可能的机制,本研究第一部分运用Hesperetin处理人胃癌细胞系（SGC-7901、MGC-803和HGC-27）,检测Hesperetin对胃癌细胞增殖凋亡作用的影响;第二部分利用H2O2和NAC调控胃癌细胞内ROS水平,明确ROS在Hesperetin抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡中发挥的作用,通过相关分子生物学实验阐明Hesperetin抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡的具体机制;第三部分构建裸鼠胃癌皮下移殖瘤模型,给予裸鼠腹腔注射Hesperetin,探讨在裸鼠体内Hesperetin对胃癌细胞增殖凋亡的影响。材料和方法1.运用不同浓度Hesperetin处理SGC-7901、MGC-803和HGC-27人胃癌细胞,检测Hesperetin对人胃癌细胞增殖的影响,并绘制生长抑制曲线、计算IC50;同时运用克隆形成实验检测Hesperetin对SGC-7901细胞克隆形成能力的影响,另外利用细胞内ROS水平检测分析Hesperetin对SGC-7901人胃癌细胞内ROS水平的影响。2.运用H2O2和NAC干扰Hesperetin引起的ROS蓄积,检测空白对照组、Hesperetin 组、Hesperetin+ H2O2 组和 Hesperetin+ NAC 组细胞内 ROS 水平改变,同时运用CCK-8和克隆形成实验检测四组细胞增殖能力改变,分析ROS在Hesperetin抑制人胃癌细胞增殖的作用。3.运用 H2O2 和 NAC 干扰 Hesperetin 引起的 ROS 蓄积,Hoechst、FACS 和western-blot 检测空白对照组、Hesperetin 组、Hesperetin+ H2o2 组和 Hesperetin+ NAC组细胞内凋亡细胞所占比例及凋亡蛋白表达水平改变、运用线粒体膜电位水平检测试验比较四组细胞中线粒体膜电位水平变化,分析ROS在Hesperetin诱导人胃癌细胞凋亡中的作用。4.运用线粒体膜渗透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）特异性抑制剂环孢素A（cyclosporin A,CsA）干扰mPTP的开放、线粒体Ca2+单向转运体（mitochondrial calcium uniporter,MCU）特异性抑制剂 Ru360 抑制MCU引起的Ca2+内流入线粒体,利用western-blot检测线粒体及胞浆中线粒体凋亡通路相关蛋白的表达水平以及线粒体内Ca2+水平。5.将SGC-7901人胃癌细胞接种入裸鼠右侧后背部皮下,构建裸鼠皮下移植瘤模型,同时给予腹腔注射不同浓度的Hesperetin,检测胃癌细胞增殖能力的改变,同时TUNEL法检测Hesperetin对人胃癌细胞凋亡的影响。结果1.CCK-8实验结果发现,Hesperetin能明显抑制SGC-7901、MGC-803和HGC-27人胃癌细胞生长,并呈现出时间依赖性和浓度依赖性。Hesperetin处理SGC-7901、HGC-27 和 MGC-803 人胃癌细胞 36h 的 IC50分别为 300μM、420μM 和450μM。克隆形成实验结果发现,不同浓度（0、25、50、100、200和400μM）的Hesperetin作用SGC-7901细胞3d后,随着Hesperetin浓度增加,细胞克隆数逐渐减少,表明Hesperetin能抑制胃癌细胞的克隆形成（P<0.05）。Hochest33258细胞凋亡染色试验结果发现,与对照组相比,Hesperetin处理组发生凋亡的细胞比例明显升高,用100、200和400μM的Hesperetin处理24h分别能诱导1.3 ± 0.46、8.1 ± 1.01,17.6 ± 1.73 和 31.4 ± 1.52%的 SGC-7901 细胞发生凋亡（P<0.05）。Western-blot实验结果显示,与对照组相比,Hesperetin处理组Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9等凋亡相关蛋白表达升高,而Bcl-2、procaspase-3和procaspase-9等抗凋亡蛋白表达明显下降（P<0.05）。细胞内ROS水平检测试验发现,与对照组相比,Hesperetin处理组细胞相对荧光值显著升高,表明SGC-7901细胞内ROS水平明显升高（P<0.05）。2.细胞内ROS水平检测发现,与Hesperetin组相比,Hesperetin+H2o2组细胞内ROS水平显著升高,而Hesperetin+NAC组细胞内ROS水平下降（P<0.05）。CCK-8细胞增殖试验结果显示,与空白对照组相比,Hesperetin组胃癌细胞增殖受到明显抑制,而与Hesperetin组相比,Hesperetin+H2o2组的细胞增殖抑制率更高,Hesperetin+NAC组的细胞增殖抑制率降低（P<0.05）。克隆形成实验结果显示,而Hesperetin+H2o2组细胞克隆形成数少于Hesperetin组（P<0.05）,Hesperetin+NAC组细胞克隆形成数多于Hesperetin组（P<0.05）,表明H2O2能增强Hesperetin对胃癌细胞克隆形成能力的抑制作用,而NAC能减轻为Hesperetin对胃癌细胞克隆形成能力的抑制作用。3.Hoechst细胞凋亡试验结果显示,与空白对照组相比,Hesperetin组胃癌细胞凋亡率明显增加（18.1±1.01%,P<0.05）,但Hesperetin+H2O2组的细胞凋亡率（28.7 ± 1.33%）显著高于与Hesperetin组,而Hesperetin+NAC组细胞凋亡率（10.6±1.19%）明显低于Hesperetin组（P<0.05）。FACS检测细胞凋亡结果显示,空白对照组、Hesperetin组、Hesperetin+H2o2组和Hesperetin+NAC组细胞凋亡率分别为（0.30%±0.06%）、（22.51%± 1.94%）、（39.63%±4.50%）和（3.62%± 1.15%）。Western blot 实验结果显示,与 Hesperetin 组比较,Hesperetin+H2o2 组细胞 Bax、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 表达上升而 Bcl-2、procaspase-3 和 procaspase-9等表达水平下降,同时 Hesperetin+NAC 组细胞 Bax、cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9表达下降而Bcl-2、procaspase-3和procaspase-9等表达水平上升。线粒体膜电位检测试验结果表明,Hesperetin组细胞内线粒体膜电位（△Ψm）明显低于空白对照组,与Hesperetin组相比Hesperetin+H2o2组细胞内线粒体膜电位（△Ψm）更低而Hesperetin+NAC组细胞内线粒体膜电位（△Ψm）升高（P<0.05）。4.线粒体内Ca2+浓度检测发现,与空白对照组相比,Hesperetin组细胞线粒体内Ca2+浓度明显升高,CsA组变化不明显,而Ru360组细胞线粒体内Ca2+浓度明显降低（P<0.05）。而与Hesperetin组相比,Hesperetin+H2o2组细胞线粒体内Ca2+浓度升高,Hesperetin+NAC组和Hesperetin+Ru360组细胞线粒体内Ca2+浓度明显降低（P<0.05）,表明Hesperetin是通过引起细胞内ROS蓄积,激活MCU Ca2+通道,导致线粒体内Ca2+浓度增加。Western-blot实验结果发现,与空白对照组相比,Hesperetin组线粒体中Apaf-1、AIF和Cyt C的表达下降而胞浆中Apaf-1、AIF和Cyt C的表达上升,而CsA组、Ru360组线粒体和无线粒体胞浆中上述蛋白表达变化与Hesperetin组相反（P<0.05）,表明Hesperetin可促进线粒体内Apaf-1、AIF和Cyt C进入细胞浆,而CsA和Ru360可抑制线粒体内Apaf-1、AIF和Cyt C进入细胞浆,与Hesperetin组相比,Hesperetin+H2o2这种变化更加明显,Hesperetin+NAC 组、Hesperetin+CsA 和 Hesperetin+Ru360 组上述变化减弱（P<0.05）,表明Hesperetin是通过引起细胞内ROS蓄积,促进mPTP开放和线粒体内Apaf-1、AIF和CytC进入细胞浆。5.裸鼠皮下成瘤实验发现,Hesperetin组移植瘤生长速度明显减慢,且随着Hesperetin浓度增加,移植瘤生长速度越慢,DMSO组、Hesperetin低剂量组、Hesperetin中剂量组和Hesperetin高剂量组移植瘤体积分别为（2O23 ± 137.6 mm3）、（1274.7 ± 123.8 mm3）、（983.4 ± 99.6 mm3）和（726.8 ± 81.3 mm3）,与 DMSO 组相比,其余三组皮下肿瘤体积明显较小（P<0.05）,四组移植瘤重量分别为（1.89±0.23g）、（1.13±0.19g）、（0.78±0.13g）和（0.46±0.11g）,与 DMSO组相比,其余三组皮下肿瘤重量明显较轻（P<0.05）,表明Hesperetin能抑制胃癌细胞的体内增殖。HE染色未发现心、肝、脾、肺、肾和脑等组织器官明显转移灶。TUNEL法检测结果显示,DMSO组、Hesperetin低剂量组、Hesperetin中剂量组和Hesperetin高剂量组移植瘤组织细胞凋亡率分别为11.56%± 2.12%、23.08%±3.41%、31.47%±3.15%和 49.56%±5.73%（P<0.05）,表明 Hesperetin 可诱导胃癌细胞的体内凋亡。结论Hesperetin通过引起胃癌细胞内ROS蓄积,一方面直接促进线粒体膜渗透性转运孔开放,同时也可促进胞浆中Ca2+浓度增加进而使胞浆中Ca2+经线粒体膜Ca2+单向转运体MCU进入线粒体,提高线粒体内Ca2+浓度而间接促进线粒体膜渗透性转运孔开放,导致线粒体内Apaf-1、AIF和Cyt C等蛋白外流进入胞浆,激活caspase线粒体凋亡通路,引起胃癌细胞凋亡,发挥抗胃癌作用。