论文部分内容阅读
【研究背景】胃癌（gastric cancer,GC）起自胃黏膜上皮,是全球第五位最常见的癌症,位于全球领域致死性恶性肿瘤第二,且60%以上的胃癌病例分布在发展中国家。因胃癌治疗方法较为丰富,胃癌患者的总生存率较前有所改善,但是5年生存率仍低于30%,可严重危害人民健康。机体对肿瘤细胞的炎症反应可能影响肿瘤的进展,从部分研究可知全身炎症反应标志物如中性粒细胞/淋巴细胞比率（neutrophil-lymphocyte ratio,NLR）可能影响恶性肿瘤患者的预后。中性粒细胞不仅可以在正常组织中出现,具有吞噬杀菌、激活免疫系统的功能,还可以出现在肿瘤及癌旁组织中,这些中性粒细胞就是肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neutrophils,TANs）。TANs与肿瘤的发生发展有紧密联系。浸润于肿瘤微环境中的TANs可向N1、N2型发生极化从而发挥不同的功能。Met即跨膜酪氨酸激酶受体,由原癌基因MET编码,不仅表达于肿瘤细胞,在免疫细胞表面亦有表达。有报道提示表达于中性粒细胞表面的Met在抑制肿瘤进程方面起到极大的作用。本研究将探究Met+中性粒细胞能否抑制胃癌的生长、侵袭、转移等恶性行为以及MET基因在TANs亚群极化中的作用,同时我们将研究外周血NLR对胃癌患者肿瘤分期、分化等临床特征及预后的影响。这对我们临床评估肿瘤患者进展及制订针对性诊疗手段有重要意义。【研究方法】1.Met+中性粒细胞对胃癌增殖、侵袭的作用（1）分选Met+中性粒细胞:收集胃癌患者外周血,加入枸橼酸钠抗凝,右旋糖酐沉降红细胞,Ficoll-Hypaque收集外周血中性粒细胞,Met流式抗体标记,FACS筛选出Met+中性粒细胞。（2）Met+中性粒细胞对胃癌细胞的作用:以Met+中性粒细胞为实验组,Met-中性粒细胞为对照组,与胃癌细胞共培养,分别测试GC细胞活力、增殖、转移等功能学变化。2.HGF/Met信号通路在TANs极化中的作用选择Met+中性粒细胞为实验组,另设空白对照组、胃癌细胞培养上清组、HGF组、Anti-Met组、胃癌细胞培养上清+Anti-Met组、HGF+Anti-Met培养组,以Met-中性粒细胞为对照组。Western blot、PCR检测各组的中性粒细胞活化相关分子ICAM-1、Fas、TNF-α、Casp3、i NOS的表达情况。流式凋亡试验评估不同组中性粒细胞对肿瘤细胞凋亡的影响,96孔板中按中性粒细胞/胃癌细胞比例加入各处理组中性粒细胞与标记好的胃癌细胞,孵育、离心,提取上清并上机检测。3.胃癌化疗患者血液学检查中性粒细胞/淋巴细胞比率与预后的联系对中性粒细胞/淋巴细胞比率与胃癌化疗患者预后的相关性进行了Meta分析。首先我们在Pub Med、Cochrane和Web of Science上搜索相关文章。收集纳入总生存率（overall survival,OS）或无进展生存率（progression-freesurvival,PFS）的文章并用Revman 5.3软件分析行化学治疗的胃癌患者血液学检查NLR与相应的肿瘤TNM分期、分化、患者生存率及生存时间的相关性。【研究结果】1.Met+中性粒细胞对胃癌增殖、侵袭的影响1.1 CCK8实验及平板克隆显示,与Met-中性粒细胞对比,Met+中性粒细胞可明显弱化胃癌细胞的活力和增殖能力。1.2与Met+中性粒细胞共培养的胃癌细胞株发生了G2期阻滞,流式结果提示MET+中性粒细胞明显促进了胃癌细胞的凋亡。1.3 Transwell提示与Met+TANs共培养的胃癌细胞侵袭能力明显减弱,且其迁移及对划痕的修复能力更弱。2.HGF/Met信号通路在TANs极化中的作用2.1加入了胃癌细胞培养上清及HGF的两组Met+中性粒细胞检测出的N1型中性粒细胞表面标志物ICAM-1、Fas、TNF-α、Casp3、i NOS表达水平较对照组显著上调,且加入Met拮抗剂后,ICAM-1、Fas、TNF-α、Casp3、i NOS的表达量明显下降。2.2流式细胞检测发现,与加入胃癌细胞培养上清及HGF的两组Met+中性粒细胞共培养的胃癌细胞凋亡数量更多,并且Met拮抗剂可逆转胃癌细胞凋亡的趋势。3.胃癌化疗患者血液学检查中性粒细胞/淋巴细胞比率与预后的联系我们将行化疗的胃癌病人分为高NLR组与低NLR组,统计两组患者的肿瘤分期、肿瘤病理分化、总生存时间、无病生存时间等临床特征。临床相关性分析结果提示,胃癌患者外周血检查中的炎症因子中性粒细胞/淋巴细胞比率增高与患者的OS及PFS下降相关,结果具有统计学意义。虽然NLR值与肿瘤的分期、分化无必然联系,但高NLR组患者的总生存时间与无病生存时间均短于低NLR组。【实验结论】1.Met+中性粒细胞对胃癌增殖、侵袭及迁移有较强的抑制作用;2.Met是N1型肿瘤相关中性粒细胞的潜在表面标记物,N1型中性粒细胞通过HGF/Met通路发挥杀伤胃癌细胞的作用;3.外周血中性粒细胞/淋巴细胞数比率与胃癌的进展相关,能预估胃癌化疗患者的生存时间。