论文部分内容阅读
玉米是我国三大粮食作物之一,在保障国家粮食安全中发挥着不可替代的作用。玉米种子的发育始于受精卵,经历形态建成、储藏物质积累、脱水耐性的获得等几个阶段。有大量研究表明ABA在种子生长发育过程中具有重要作用,影响贮藏蛋白和脂类的积累、脱水耐性的获得及种子休眠的诱导和维持等。许多生理学和遗传学揭示了 ABA在种子发育中的关键作用,但很少有研究致力于ABA通过调控哪些基因和途径来影响玉米种子发育,因此,本研究以玉米突变体vp5和野生型Vp5授粉后15d、22d、29d、36d的种胚为材料,通过转录组技术系统研究ABA调控玉米种子发育的分子机制,并通过基因共表达网络（WGCNA）分析找出ABA调控种子发育的关键基因,主要研究结果如下:（1）通过LC/MS分析方法测定两种材料种子发育过程中ABA动态含量,在种子发育早期,两种材料种胚中ABA含量差异不大,从授粉后29d开始,Vp5种胚内ABA含量开始迅速上升,vp5种胚内ABA含量开始逐渐下降,在授粉后36d（成熟脱水期）时,突变体vp5种胚内ABA的含量仅为野生型Vp5的四分之一,表明种子发育后期是ABA诱导基因表达的关键期。（2）本研究使用碱基质量值来对RNA-Seq得到的原始数据进行质量评估,本次测序共获得167.44G的Clean Data,各样本的有效数据量分布在6.92～7.01G,≥Q30碱基分布在94.32～96.45%,平均GC含量为54.42%。reads比对到参考基因组上的比对率为88.85～92.59%,其中在参考序列上有唯一比对位置的测序序列比在参考序列上有多个比对位置的测序序列的比列高的多,且测序序列比对到基因组上正链和负链上的比例相当,表明本次测序数据可靠,可用于后续分析。（3）将所有基因表达量用FPKM值表示,把归一化reads FPKM值低于0.5的基因剔除。野生型Vp5 的 15DAP、22DAP、29DAP 和 36DAP 分别表达 20216、19809、19541 和 18809个转录本;相同的,突变体vp5的15DAP、22DAP、29DAP和36DAP分别表达了 20120、19634、19408 和 19030 个转录本。（4）通过比较两种材料发育过程中的差异基因发现,在Vp5发育过程中有21768个基因在每个阶段都表达,有622个基因在15DAP阶段特异表达,有298个基因在22DAP阶段特异表达,有335个基因在29DAP阶段特异表达,有425个基因在36DAP阶段特异表达;在vp5发育过程中有21720个基因在每个阶段都表达,有762个基因在15DAP阶段特异表达,有294个基因在22DAP阶段特异表达,有231个基因在29DAP阶段特异表达,有427个基因在36DAP阶段特异表达,每个时期都表达的基因占大多数,表明发育时期是决定基因表达的关键因素。（5）通过比较两种材料同一发育时期的差异基因发现,共鉴定出1019个差异表达基因,在15DAP时,vp5与Vp5比较有87个差异表达基因（其中8个上调,79个下调）;在22DAP时,vp5与Vp5比较只有9个差异表达基因（9个下调）,是差异基因数量最少的时期;在29DAP时,有105个差异表达基因（69个上调,36个下调）;在36DAP时,差异表达基因数量最多,有818个（其中306个上调,512个下调）。（6）对36DAP时期两个材料的差异基因做GO功能富集分析,发现36DAP时期vp5和Vp5比较下调表达的差异基因在生物过程中富集值最高的功能类别是柠檬酸盐转运,其次是负调控油菜素类固醇介导的信号通路、一氧化氮生物合成过程、无氧呼吸和蜡生物合成;在细胞组分上富集值最高的功能类别是蛋白质复合物;在分子功能上富集值最高的是柠檬酸盐跨膜转运蛋白活性、丙酮酸激酶活性和钾离子结合上。上调表达的差异基因在生物过程中富集值最高的功能类别是不饱和脂肪酸生物合成过程和脂肪酸生物合成过程;细胞组分上富集值最高的功能类别是DNA聚合酶:引物酶复合物;在分子功能上富集值最高的是3-氧代酰基合酶活性。表明ABA合成缺陷突变体vp5的种子在发育后期代谢活动较活跃。（7）对36DAP时期两个材料的差异基因做KEGG通路富集分析,结果发现36DAP时期yp5和Vp5 比较下调的差异表达基因主要富集在糖酵解/糖异生通路、植物激素信号转导通路、MAPK信号通路和内质网中蛋白质的加工通路,上调的差异表达基因主要富集在脂肪酸生物合成通路和嘌呤代谢通路,其次是糖酵解/糖异生通路和淀粉和蔗糖代谢通路。结果表明ABA影响多种代谢途径影响种子发育。（8）过滤表达量变化波动较低（标准偏差≤0.3）的基因,最终剩余15259个基因,在基因表达两两相关的基础上构建共表达网络。共获得8个共表达模块,通过与ABA动态含量的关联分析,筛选出一个与ABA含量负相关的模块,通过GO分析显示,与ABA相关模块的功能主要富集在代谢过程和细胞过程上,表明ABA合成缺失突变体的种子在发育过程中代谢活动较旺盛,缺少休眠启动。进一步分析模块内的Hub基因,发现ABA可能通过负调控编码硫胺素生物合成的基因、编码NPF家族蛋白的基因、编码钙调蛋白的基因以及编码金属硫样蛋白的基因来影响种子发育。总之,本研究通过比较转录组结合基因共表达网络（WGCNA）分析的方法,系统分析了野生型Vp5和突变体vp5发育过程中种胚的差异表达基因,结果发现ABA通过调控多种基因表达来调控玉米种子的发育,本研究结果将为解析ABA调控种子发育的分子机制提供思路,为研发玉米新品种提供理论基础。