背景:胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤,具有复发率高、转移率高,预后差等特点,预计在不久的将来将成为第三大死因。由于缺乏有效的早期诊断方法,大多数胰腺癌患者在确诊时都处于进展期,只有不到20%患者适合手术治疗。化疗是胰腺癌的重要治疗手段,然而化疗耐药却成为胰腺癌临床治疗中亟需解决的难题之一。尽管在过去的十年里已经做出了相当大的努力来确定药物研发靶点,并开发了许多包含靶向治疗、免疫治疗等的联合疗法,但胰腺癌的治疗没有取得太大进展,五年生存率仍保持在10%。因此,寻找调控胰腺癌发生发展的关键基因,为开发更有效的胰腺癌治疗方法提供理论基础。G蛋白偶联受体C类第5组成员A（GPRC5A）,也称视黄酸诱导蛋白3（RAI3）或视黄酸诱导基因1（RAIG1）,是GPCRs家族的成员。近年来有研究结果表明GPRC5A在肺癌、头颈部及口腔鳞状细胞癌中低表达,作为肿瘤抑制因子。过表达GPRC5A抑制上述肿瘤的进展。但GPRC5A在胃癌、卵巢癌、前列腺癌中高表达促进肿瘤的发生及转移。目前国内外研究主要探讨GPRC5A可能在胰腺癌中扮演致癌基因,且与吉西他滨耐药相关,但其促癌的具体机制还未完全明确。因此,寻找GPRC5A下游关键分子及其在胰腺癌中的作用机制仍具有重要意义。神经肽S受体1（NPSR1）也称为孤儿G蛋白偶联受体154（GPR154）或哮喘易感性G蛋白偶联受体（GPRA）,是GPCRs家族成员之一。NPSR1在肿瘤中的研究较少,仅发现NPSR1在神经内分泌肿瘤及肺腺癌中高表达,可作为神经内分泌肿瘤及肺腺癌的生物标志物。另外,NPSR1可能促进胰腺癌细胞的恶性生物学行为。所以,NPSR1可能在胰腺癌中扮演致癌基因,但其促癌的具体分子机制尚不明确,也未见相关的研究报道。因此,探究NPSR1在胰腺癌中的临床意义及其在胰腺癌中的功能作用和分子机制,有望为胰腺癌临床治疗、预后判断及可能的干预靶点提供新的思路和方向。第一章GPRC5A通过c AMP-CREB轴干扰Hippo信号通路促进胰腺癌细胞增殖和迁移目的:研究GPRC5A对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响,并深入研究GPRC5A促进胰腺癌进展的分子机制。方法:使用生物信息学检测GPRC5A在胰腺癌组织中的表达以及与胰腺癌患者临床病理特征及生存预后的相关性。实时定量PCR、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹方法检测胰腺癌组织及细胞中GPRC5A的表达。使用CCK-8、平板克隆形成、划痕和transwell实验以及建立胰腺癌异种移植模型等,探讨GPRC5A在胰腺癌中的生物学功能。利用RNA芯片测序、生物信息学、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法及细胞回复实验探讨GPRC5A对Hippo信号通路的调控作用。利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法探讨GPRC5A对c AMP-CREB信号通路的调控作用。结果:GPRC5A在胰腺癌组织及细胞中高表达,且高表达GPRC5A与胰腺癌患者临床病理特征及预后不良显著相关。敲低GPRC5A显著减弱了胰腺癌细胞的增殖及迁移能力,且沉默GPRC5A表达可抑制裸鼠体内肿瘤生长。从机制上讲,GPRC5A和YAP1及其下游靶基因在胰腺癌中存在显著正相关。敲低或过表达GPRC5A可显著降低或升高YAP1及其靶基因CYR61、cyclin D1、c-Myc和CTGF的m RNA及蛋白水平,然而不会影响调控YAP1活性的上游激酶如MST1/2、LATS1/2及其磷酸化蛋白水平。此外,在敲低或过表达GPRC5A后,YAP1和p-YAP1蛋白表达都是下调或上调,两者的变化是同步,而且两者之间的比率没有显著差异。总之,我们的结果表明GPRC5A通过促进YAP1转录来影响Hippo信号通路。然后,为了进一步确定YAP1在GPRC5A介导的胰腺癌进展中发挥的作用,在敲低GPRC5A的胰腺癌稳转细胞株中转染YAP1过表达质粒,蛋白质免疫印迹实验证实上调YAP1仅增加YAP1及其靶基因CYR61的表达而对GPRC5A表达基本不影响。此外,YAP1过表达部分逆转了敲低GPRC5A对YAP1及其靶基因CYR61的抑制作用。反之,在胰腺癌细胞中共转染GPRC5A过表达质粒和YAP1 si RNA进行回复实验,蛋白质免疫印迹实验证实干扰YAP1只会降低YAP1及其靶基因CYR61表达,而不会影响GPRC5A表达。此外,YAP1缺陷部分抵消了过表达GPRC5A上调YAP1及其靶基因CYR61的影响。而且功能实验证实过表达GPRC5A促进胰腺癌细胞的增殖及迁移能力,然而干扰YAP1可部分逆转过表达GPRC5A对胰腺癌细胞增殖及迁移能力的影响。因此,我们的研究结果表明,抑制YAP1有利于破坏GPRC5A对胰腺癌细胞的不利影响。最后,敲低或过表达GPRC5A可降低或升高c AMP的m RNA表达。此外,沉默或过表达GPRC5A会显著减少或增加p-CREB表达,而不会影响总CREB蛋白表达。并且敲低GPRC5A可降低细胞核内p-CREB水平,并促进细胞质中p-CREB表达。然而,过表达GPRC5A可增加细胞核内p-CREB,而细胞质内pCREB表达下调。因此,我们的数据表明,GPRC5A通过促进c AMP表达及CREB的磷酸化调控YAP1 m RNA表达介导Hippo通路。结论:GPRC5A通过调控Hippo通路核心蛋白YAP1的表达,来促进胰腺癌的进展。这些发现揭示了GPRC5A与Hippo通路的交互作用,有利于对胰腺癌进展的深入了解。第二章NPSR1通过调控MAPK信号通路促进胰腺癌细胞增殖和转移目的:研究NPSR1对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响,并探讨NPSR1促进胰腺癌进展的分子机制。方法:使用生物信息学检测NPSR1在胰腺癌组织中的表达以及与胰腺癌患者生存预后的相关性。实时定量PCR、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹方法检测胰腺癌组织及细胞中NPSR1的表达。使用CCK-8、平板克隆形成和transwell实验以及建立胰腺癌异种移植模型等,探讨NPSR1在胰腺癌中的生物学功能。利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法及细胞回复实验探讨NPSR1对MAPK信号通路的调控作用。结果:NPSR1在胰腺癌组织及细胞中高表达,且高表达NPSR1与胰腺癌患者的预后不良显著相关。敲低或过表达NPSR1显著减弱或促进胰腺癌细胞的增殖及侵袭能力,且过表达NPSR1表达可促进裸鼠体内肿瘤生长。从机制上讲,干扰NPSR1显著下调N-cadherin与Vimentin的表达及上调Ecadherin的表达。反之,过表达NPSR1显著上调N-cadherin与Vimentin的表达及下调E-cadherin的表达。因此,NPSR1通过影响EMT进程促进胰腺癌的进展。然后,既往研究报道NPSR1可以激活JNK/ERK MAPK通路来影响肿瘤的进展。我们的结果表明干扰或过表达NPSR1后,p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平显著降低或升高,然而ERK1/2和JNK的总蛋白水平无明显变化。因此,NPSR1可激活胰腺癌中的JNK/ERK MAPK信号通路。最后,由于EMT及MAPK信号通路都可以被NPSR1激活,我们探究NPSR1是否通过调控JNK/ERK MAPK信号通路影响EMT过程。我们在过表达NPSR1的胰腺癌稳转细胞株中分别使用JNK抑制剂（SP600125）及ERK1/2抑制剂（SCH772984）,发现过表达NPSR1可上调N-cadherin与Vimentin及下调Ecadherin的表达,然而同时加入SP600125及SCH772984后,可部分逆转过表达NPSR1对N-cadherin与Vimentin促进作用以及对E-cadherin的抑制作用。而且功能实验证实过表达NPSR1可显著促进胰腺癌细胞的增殖及侵袭能力,然而同时加入SP600125或SCH772984后,可部分逆转NPSR1对胰腺癌细胞的增殖及侵袭能力的影响。结论:我们的结果提示NPSR1通过调控MAPK信号通路促进胰腺癌细胞的增殖及转移。这些发现提示NPSR1可能是胰腺癌潜在生物标志物和治疗靶点。