研究背景与目的:据世界卫生组织调查,结直肠癌在各类恶性肿瘤的发病率中排名第三位,死亡率跃升第二位,对人类健康构成严重威胁。由于早期症状不明显,大部分患者确诊时已是伴有肿瘤转移的晚期阶段,5年生存率非常低。结直肠癌的发生发展是一种多因素多阶段的过程,受到了许多基因和信号通路的差异改变的影响。越来越多的研究表明circ RNA相较于线性RNA,其在物种间的表达更为丰富。在真核生物中,它们已被证明为稳定,保守的分子,以组织/发育特异性模式大量表达,更有潜力成为癌症临床实践中理想的诊断和预后生物标志物以及有效的治疗靶点。它们参与调控与癌症有关的基因的表达,与致癌通路及机制有关。许多circ RNA含有各种类型和数量的miRNA结合位点,这些位点特异性结合miRNA,从而降低miRNA活性并上调miRNA靶基因的表达。据估计,超过一半的人类m RNA是保守的miRNA靶标,因此circ RNA被认为通过调节基因表达而发挥广泛的作用。我们通过整理生物信息学数据,并进行了初步的分子鉴定。在我们的前期结果中显示,hsa＿circ＿0062682更多地表达在结直肠癌组织中。敲低hsa＿circ＿0062682的表达,结直肠癌细胞的增殖能力明显减弱。因此,我们选定本次研究所需基因:hsa＿circ＿0062682。hsa＿circ＿0062682,来源于chr22:26936754-26937684,长度为930 bp,由亲本基因TPST2的2号外显子反向剪切成环而成。最近的研究表明hsa＿circ＿0062682可以促进多种癌症的增殖、迁移和侵袭,但关于hsa＿circ＿0062682是否以ce RNA机制参与结直肠癌的发生发展仍不清楚。本研究将深入分析hsa＿circ＿0062682与结直肠癌之间的相关性,探索其在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制,为提供准确的诊断生物标志物和有价值的治疗靶标提供重要的实验依据。第一部分hsa＿circ＿0062682在结直肠癌中的表达及临床相关性方法:1.用RT-qPCR法检测hsa＿circ＿0062682在正常肠组织和结直肠癌组织中的表达。2.根据hsa＿circ＿0062682在结直肠癌组织中的表达中位值分为hsa＿circ＿0062682高表达组和hsa＿circ＿0062682低表达组,结合患者的临床病理特征,明确hsa＿circ＿0062682的表达是否与结直肠癌的发生发展相关。结果:1.RT-qPCR检测结果表明,与正常肠组织相比,hsa＿circ＿0062682在结直肠癌组织中明显高表达。2.与hsa＿circ＿0062682低表达组相比,hsa＿circ＿0062682高表达组患者的分期更晚,更容易发生淋巴结转移及远处转移。结论:1.hsa＿circ＿0062682在结直肠癌组织中明显高表达。2.hsa＿circ＿0062682的表达与结直肠癌患者的分期、淋巴结转移及远处转移相关。第二部分hsa＿circ＿0062682的生物学特征及对结直肠癌细胞的影响方法:1.用RT-qPCR法检测hsa＿circ＿0062682在正常肠上皮细胞（NCM460）和结直肠癌细胞系（HCT116、LOVO、DLD1、SW620、SW480）中的表达。2.Sanger测序、放线菌素D、Rnase R及核质分离实验检测hsa＿circ＿0062682的生物学特征。3.将si-hsa＿circ＿0062682或hsa＿circ＿0062682过表达质粒转染进SW480和SW620中,利用CCK-8、Ed U、划痕愈合、Transwell小室等实验检测hsa＿circ＿0062682对结直肠癌细胞生物学行为的影响。结果:1.RT-qPCR结果表明,与正常肠上皮细胞相比,hsa＿circ＿0062682在结直肠癌细胞系中明显高表达。2.Sanger测序验证hsa＿circ＿0062682具有头尾剪接的环状结构,放线菌素D、Rnase R实验验证hsa＿circ＿0062682的稳定性,核质分离实验明确hsa＿circ＿0062682在细胞质中的富集。3.敲低hsa＿circ＿0062682后,结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力被减弱。而过表达hsa＿circ＿0062682后可明显增强细胞的增殖、迁移及侵袭能力。结论:1.hsa＿circ＿0062682在结直肠癌细胞中高表达。2.hsa＿circ＿0062682具有环状RNA的生物学特性。3.hsa＿circ＿0062682促进了结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。第三部分hsa＿circ＿0062682通过miR-497-5p/Axin2促进结直肠癌进展方法:1.利用生物信息学、双荧光素酶报告基因检测、RT-qPCR法筛选miR-497-5p为hsa＿circ＿0062682的下游miRNA分子。2.将miR-497-5p mimics、miR-497-5p inhibitor作用于结直肠癌细胞,利用CCK-8、划痕愈合、Transwell小室实验检测miR-497-5p对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。3.利用生物信息学、双荧光素酶报告基因检测、RT-qPCR法筛选Axin2为miR-497-5p的下游m RNA分子。4.沉默Axin2的表达后,利用CCK-8、Ed U、划痕愈合、Transwell小室实验检测Axin2对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。5.挽救实验进一步验证hsa＿circ＿0062682靶向miR-497-5p调控结直肠癌细胞的增殖和转移。6.挽救实验进一步验证miR-497-5p靶向Axin2调控结直肠癌细胞的增殖和转移。结果:1.miR-497-5p是hsa＿circ＿0062682的下游靶标,在结直肠癌细胞中低表达,并且受hsa＿circ＿0062682的调控。2.miR-497-5p mimics作用下的结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭均受到了明显的抑制。而在miR-497-5p inhibitor作用下的结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭显著增强。3.Axin2是miR-497-5p的下游靶基因,它的表达受miR-497-5p的调控。4.沉默Axin2的表达后,结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均被减弱。5.hsa＿circ＿0062682可以减弱miR-497-5p介导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。另一方面,hsa＿circ＿0062682的沉默也逆转了miR-497-5p抑制剂介导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用。6.Axin2可以减弱miR-497-5p介导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。另一方面,Axin2的沉默也逆转了miR-497-5p抑制剂介导的结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用。结论:1.hsa＿circ＿0062682靶向调控miR-497-5p在结直肠癌细胞中的表达。2.miR-497-5p抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3.miR-497-5p靶向调控Axin2在结直肠癌细胞中的表达。4.Axin2促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。5.hsa＿circ＿0062682可以通过减弱miR-497-5p的肿瘤抑制活性从而促进结直肠癌细胞恶性进展。6.miR-497-5p通过靶向Axin2来抑制结直肠癌细胞的进展。第四部分hsa＿circ＿0062682通过Wnt/β-catenin/EMT通路促进结直肠癌进展方法:1.利用Western-blot检测沉默hsa＿circ＿0062682后结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的表达。2.挽救实验验证hsa＿circ＿0062682靶向miR-497-5p调控结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的表达。3.挽救实验验证miR-497-5p靶向Axin2调控结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的表达。4.将稳定转染慢病毒sh-hsa＿circ＿0062682的结直肠癌细胞接种于裸鼠皮下,构建裸鼠结直肠癌移植瘤模型,观察hsa＿circ＿0062682对移植瘤生长的影响。RT-qPCR检测瘤体组织中hsa＿circ＿0062682和miR-497-5p的表达。5.免疫组织化学分析检测结直肠癌移植瘤组织中Axin2及EMT相关蛋白的表达。结果:1.沉默hsa＿circ＿0062682后,结直肠癌细胞中的Axin2、β-catenin、N-cadherin、Vimentin的表达均被下调,E-cadherin表达升高。2.共转染hsa＿circ＿0062682后,在一定程度上可以抵消miR-497-5p介导Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的抑制作用。另一方面,hsa＿circ＿0062682的下调也逆转了miR-497-5p抑制剂介导的结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的促进作用。3.共转染Axin2后,增加的Axin2可以部分抵消miR-497-5p介导Wnt/β-catenin通路相关蛋白的抑制。另一方面,miR-497-5p抑制剂介导的结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白的促进作用在共转染Si-Axin2后也被削弱。4.与对照组相比,sh-hsa＿circ＿0062682组裸鼠移植瘤的体积和重量均降低。RT-qPCR表明hsa＿circ＿0062682在瘤体组织中的表达被敲低,miR-497-5p的表达是升高的。5.免疫组织化学分析显示,与对照组相比,sh-hsa＿circ＿0062682组移植瘤组织中Axin2、Vimentin、N-cadherin表达均被显著降低,而E-cadherin表达升高。结论:1.沉默hsa＿circ＿0062682抑制Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的表达。2.hsa＿circ＿0062682靶向miR-497-5p调控Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的表达。3.miR-497-5p靶向Axin2调控Wnt/β-catenin/EMT通路相关蛋白的表达。4.沉默hsa＿circ＿0062682抑制裸鼠体内结直肠癌移植瘤的生长。5.沉默hsa＿circ＿0062682抑制了EMT相关蛋白的表达。