研究背景:脓毒症是一种由感染导致的失控的宿主反应,伴随着危及生命的器官功能障碍,是危重患者可预防性死亡的主要原因。脓毒症也是一种高度异质性的综合征,具有复杂的免疫病理生理的改变,脓毒症患者如不及时治疗可发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）。MODS定义为两个或两个以上器官系统的进行性生理功能障碍,需要ICU干预以维持内环境稳态。一旦被诊断为MODS,败血症患者的死亡率可高达28-56%,因此MODS被认为是失调的全身炎症反应的最后阶段。中性粒细胞是机体对感染病原体最先做出反应的先天免疫细胞,在宿主防御中起着至关重要的作用。脓毒症期间中性粒细胞的过度激活及在远端重要脏器中的浸润已被发现是脓毒症多器官损伤的关键机制。胰石蛋白（pancreatic stone protein/regenerating protein,PSP/Reg）是一种在脓毒症期间过度表达的c型凝集素蛋白,相关研究发现其在多种炎症性疾病中均表达上调,并具有与中性粒细胞直接结合的能力,但其与MODS的相关性研究较少。本研究通过临床研究、建立脓毒症动物模型及体内外实验等方式,探索PSP/Reg在脓毒症患者MODS中的作用及其可能的调控机制,以期为临床治疗提供新的治疗策略和思路。第一章:PSP/Reg在脓毒症患者中的临床意义目的:探讨外周血PSP/Reg浓度对脓毒症患者MODS的发生及预后的预测价值方法:1、前瞻性收集2021年9月至2022年10月期间南昌大学第一附属医院ICU收治的符合脓毒症诊断标准（Sepsis 3.0）的成人患者（141例）。2、患者入院时收集临床资料,24小时内收集血液样本,使用ELISA法检测外周血PSP/Reg浓度。所有患者入组后接受标准治疗干预,所有治疗决策由临床医师决定,检测结果对临床医师实行单盲。每日评估序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment,SOFA）;记录器官支持治疗情况;记录患者一般情况及肝、肾功能、心肌酶谱、氧合指数等器官损伤标志物。3、根据Sepsis3.0标准将所有入组患者分为脓毒症组、脓毒症休克组;根据入院后48-72小时内是否发生MODS进展分为MODS组及非MODS组（MODS的定义为SOFA评分≥5分）,根据患者入院后28天内是否发生死亡分为生存组、死亡组。4、统计分析患者入院时外周血PSP/Reg浓度与患者疾病严重程度、器官支持治疗强度、MODS进展及预后的关系,并评估PSP/Reg预测患者MODS进展及预后的价值。结果:1、脓毒症休克组的外周血PSP/Reg水平（347.1ng/m L[179.1,665.2]）明显高于脓毒症组（82ng/m L[62,297.7]）（p＜0.001）。2、根据患者入院时SOFA评分将患者分层,可以观察到PSP/Reg水平与SOFA评分正相关（p＜0.0001）。3、使用Spearman秩相关性检验分析显示PSP/Reg水平与患者对器官支持治疗的依赖程度相关,包括入院时对血管加压药的剂量（r=0.496;p＜0.0001）;使用血管加压药时间（r=0.545;p＜0.0001）;以及机械通时间气（r=0.607;p＜0.01）;RRT治疗时间（r=0.360;p=0.015）。4、MODS组外周血PSP/Reg水平明显高于非MODS组（427.2ng/m L[268,951.2]vs 213.8ng/m L[136.8,536.4];p＜0.001）。5、死亡组外周血PSP/Reg水平显著高于存活组（427.2ng/m L[289,842.1]vs208.1ng/m L[135.3,516.2];p＜0.001）。6、调整性别、年龄等因素的多元log回归分析显示,外周血PSP/Reg水平是患者入院后48-72h进展为MODS和28天死亡率的独立危险因素（OR:1.012[1.003,1.020],p=0.005;OR:1.006[1.002,1.010],p＜0.001）。7、ROC曲线提示PSP/Reg预测患者MODS进展的AUC:0.714,p=0.001;预测脓毒症患者28天死亡率的AUC:0.734,p＜0.001。结论:1、在成人脓毒症患者中,入院时外周血PSP/Reg浓度与患者疾病严重程度、器官支持治疗需求、MODS进展及不良预后密切相关。2、在入院24小时内测量外周血PSP/Reg浓度有助于预测患者MODS的进展及预后,以识别因器官损伤而死亡风险较高的患者,改善预后。第二章:PSP/Reg在脓毒症小鼠多器官损伤中的作用目的:探索PSP/Reg在CLP诱导的小鼠脓毒症模型中对多器官损伤的作用方法:1、构建盲结肠结扎（cecal ligation and puncture,CLP）诱导的脓毒症小鼠模型,使用生物活性的PSP/Reg处理小鼠。动物分组:对照PBS组（CLP术后30min,尾静脉注射等体积PBS）、低剂量PSP40组（CLP术后30min,尾静脉注射:40ng/kg重组PSP/Reg蛋白）,高剂量PSP400组（CLP术后30min,尾静脉注射:400ng/kg重组PSP/Reg蛋白）。2、小鼠CLP术后24小时,根据“小鼠脓毒症评分”对各组小鼠进行盲法评估。评分根据外观、意识水平、活动、刺激反应、睁眼、呼吸频率,呼吸质量七个方面对小鼠的健康状况进行评分。3、另取一批小鼠,动物分组及处理同前。在CLP术后的7天中,每12小时评估一次存活率,并绘制生存曲线。4、小鼠CLP术后24小时,对各组小鼠施行安乐死,使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组小鼠外周血炎症因子（TNF-α,IL-6,IL-1β）及器官损伤标记物（乳酸脱氢酶,肌酐,肌钙蛋白I）的水平;通过计算肺湿/干比（W/D）判断各组小鼠肺水肿程度。5、小鼠CLP术后24小时,对各组小鼠施行安乐死,收集各组小鼠肺部、心脏、肝脏和肾脏组织,制作石蜡切片,通过TUNEL染色试剂盒检测各组小鼠重要脏器中细胞凋亡水平。结果:1、与PBS组相比,低剂量及高剂量PSP组小鼠脓毒症评分均明显升高,高剂量PSP组其脓毒症评分也显著高于低剂量组,PSP/Reg以剂量依赖性的方式加重了小鼠脓毒症模型的疾病严重程度评分。2、与PBS组相比,低剂量PSP组的中位生存时间显著降低,高剂量PSP/Reg组中位生存时间进一步降低。3、与PBS组相比,低剂量PSP组的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高;与低剂量PSP组相比,高剂量PSP组进一步加重了TNF-α和IL-6的水平;但并没有进一步加重IL-1β的表达。4、与PBS组相比,低剂量PSP组器官损伤标记物乳酸脱氢酶、肌酐、肌钙蛋白I、肺湿\干重比的水平明显升高,在高剂量PSP组进一步加重了这些器官损伤标记物的水平。5、与PBS组相比,低剂量PSP组肺部、心脏、肝脏和肾脏组织切片的TUNEL阳性水平显著升高,在高剂量PSP组中组织切片的TUNEL阳性水平进一步升高。结论:动物实验证明,PSP/Reg以剂量依赖性的方式加重了脓毒症小鼠的全身炎症和多器官损伤。第三章:PSP/Reg加重多器官损伤的机制研究目的:探索PSP/Reg加重脓毒症诱导的多器官损伤的相关机制方法:1、CLP动物造模及分组同前,使用MPO（髓过氧化物酶）试剂盒、组织切片免疫荧光法检测各组小鼠肺部、心脏、肝脏和肾脏中氧化应激及中性粒细胞的浸润水平。2、采用小鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离各组小鼠骨髓中性粒细胞,流式细胞术分析中性粒细胞活化指标CD29和ICAM-1的表达水平。3、采用小鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离C57BL/6小鼠骨髓中性粒细胞,细胞分组:对照组（LPS+等体积PBS刺激）、低剂量PSP40组（LPS+40 ng/m L重组PSP/Reg蛋白刺激）,高剂量PSP400组（LPS+400 ng/m L重组PSP/Reg蛋白刺激）。4、流式细胞术分析各组小鼠骨髓来源中性粒细胞活化指标CD29和ICAM-1的表达水平。5、q-PCR法检测各组小鼠骨髓来源中性粒细胞中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的m RNA表达水平6、SYTOX检测试剂盒检测各组小鼠骨髓来源中性粒细胞内NETs的释放水平。7、细胞ROS检测试剂盒检测各组小鼠骨髓来源中性粒细胞内ROS水平。结果:1、与PBS组比较,低剂量及高剂量PSP组小鼠重要脏器中氧化应激及中性粒细胞组织浸润水平显著升高。2、与PBS组比较,低剂量及高剂量PSP组小鼠分离的骨髓中性粒细胞表面活化因子CD29和ICAM-1的表达水平显著升高。3、在细胞实验中,与PBS组比较,低剂量及高剂量PSP组小鼠骨髓来源中性粒细胞表面活化因子CD29和ICAM-1的表达水平显著升高。4、与PBS组比较,低剂量及高剂量PSP组小鼠骨髓来源中性粒细胞促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）m RNA表达水平显著升高5、与PBS组比较,PSP/Reg刺激上调了小鼠骨髓来源中性粒细胞产生NETs水平。6、与PBS组比较,低剂量及高剂量PSP组小鼠骨髓来源中性粒细胞ROS水平显著升高结论:1、PSP/Reg处理显著增加了脓毒症小鼠重要脏器中性粒细胞的活化及组织浸润水平。2、在细胞实验中,PSP/Reg处理加重了LPS诱导的小鼠骨髓中性粒细胞的炎症反应。