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癌症治疗受益于现代生物技术的加速发展,许多免疫治疗策略如雨后春笋般涌现,如疫苗、免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体（CAR）细胞疗法、单克隆抗体和双特异性抗体等。在肿瘤免疫治疗中,T-细胞重定向的双特性抗体（Bs Ab）是通过结合具有肿瘤特异性表达的抗原蛋白,同时结合T-细胞表面的CD3分子直接激活T-细胞杀伤癌细胞,此过程不需要依赖于经典T-细胞激活途径,尤其是对于一些无免疫原性肿瘤患者提供了新的治疗策略。如近几年研究的靶向肝癌抗原GPC3的单克隆单体临床疗效不理想,而GPC3却是一个极具潜力的重定向T-细胞抗体的治疗靶点。临床上有数十种双特异性抗体结构,其中一类是抗体片段形式,如Bi TE构型,是将两个抗体的可变区（sc Fv）串联而成,虽疗效好,但血液半衰期太短;另一类则是Ig G型,保留了抗体Fc域,优点是半衰期长,而靶向恶性肿瘤的双特异性抗体还在临床试验中。目前对于双特异性抗体的研发,有效性、安全性和成药性之间的平衡比单克隆抗体更难,前期抗体构型设计显得尤为重要,需综合考虑稳定性、抗原抗体结合的灵活性和紧凑性,以及是否易于下游工艺纯化等因素。因此本研究针对上述问题设计了一种新型抗GPC3/CD3的Ig G-sc Fv构型四价双特异性抗体用于肝癌靶向治疗。本文研究的主要内容如下:（1）在构建的抗GPC3/CD3四价双特异性抗体（Bs Ab-WT）基础上,为促进抗体重、轻链的配对,在人源GPC3抗体恒定区CH1和CL链间分别引入七对新的二硫键。通过HEK293悬浮细胞分泌表达于细胞上清中,定量分析发现七对突变对引入后,目的单体含量均提高,其中CH1126/CL121（F126C/S121C）突变对引入后,所形成的目的单体含量显著提高了20%,抗聚集稳定性和热稳定性也有提升。通过流式细胞术（FCM）测定抗体与细胞表面GPC3、CD3抗原结合活性,结果显示仍保持了亲本抗体的亲和力。（2）为进一步提升单二硫键引入的四价抗体的稳定性,在GPC3抗体VH/VL的保守区再突变引入二硫键（Q100C/G44C）。结果显示抗体的抗聚集、降解和热稳定性又进一步提高,其中热稳定性提高后,其Tm值至与亲本抗体接近,并验证了稳定性的增加受益于抗体VH-CH1/VL-CL域（Fab）间双二硫键的引入;同时抗体的单体含量也提高了28%,产量优于野生型Bs Ab-WT。通过DTNB比色法证明抗体中引入的工程二硫键已形成。（3）在双二硫键引入的抗GPC3/CD3抗体Bs Ab-2SS中,通过FCM测定了其与抗原的亲和活性,其亲和力基本保持不变;新生儿Ig G Fc受体（Fc Rn）在Ig G血液循环中起着重要作用,通过生物膜干涉技术（BLI）测定抗体与Fc Rn的相互作用发现,四价抗体Bs Ab-WT和Bs Ab-2SS与Fc Rn受体在p H=7.4时,正常解离;在p H=6.0与比Ig G对照相比,两种抗体与Fc Rn的解离速度显著降低近26倍,平衡解离常数KD高3～7倍（Bs Ab-2SS高7倍）,这表明该抗体与Fc Rn结合活性增加,潜在延长了抗体在体内的半衰期。（4）为评估双二硫键引入的四价抗体体外诱导T淋巴细胞杀伤癌细胞,通过CCK-8法测定了半数有效杀伤浓度,其中抗体Bs Ab-2SS优于抗体Bs Ab-WT 3～6倍。进一步研究了Bs Ab-2SS杀伤不同肝癌细胞作用,发现该抗体对于癌细胞的杀伤呈现浓度依赖性和GPC3靶抗原依赖性,在GPC3丰度最高的Hep G2中杀伤效果最好,该作用同淋巴细胞释放的细胞因子水平正相关;在诱导T-细胞激活方面,Bs Ab-2SS能有效激活T淋巴细胞增殖分化为CD4+和CD8+T淋巴细胞。（5）通过免疫缺陷小鼠构建的肝癌异种移植瘤模型,评价了抗GPC3/CD3抗体的体内抗肿瘤活性。结果表明两个四价抗体在1 mg/kg给药浓度下均显著抑制了小鼠肿瘤的生长,Bs Ab-2SS略优于Bs Ab-WT。进一步分析小鼠肿瘤、血液中的T淋巴细胞含量,证明在Bs Ab-2SS给药后,T淋巴细胞能够有效浸润肿瘤组织。（6）通过相同双二硫键突变引入抗体Fab域,构建了两种不同人源抗体的Ig G-sc Fv四价抗体:CEA-Bs Ab-2SS和h2E-Bs Ab-2SS,相比野生型,抗体目的单体含量显著提升40-60%,纯化得率也显著提升,其中CEA-Bs Ab-2SS提高了近38倍。用BLI和FCM抗体亲和活性结果显示:二硫键的引入后抗体与抗原的结合活性变化在2倍以内,表明工程二硫键的引入对于抗体与抗原的结合构象无影响。综上所述,本研究以抗GPC3单克隆抗体疗效不佳和Ig G-sc Fv双特异性抗体结构不稳定为出发点,构建了一种新型抗GPC3/CD3四价双特异抗体,通过筛选最佳二硫键突变引入位点,进行了一系列生物物理和生物功能的研究,得到了最优的二硫键突变对组合,成功地促进了四价抗体重轻链正确配对,提高了抗体的稳定性,补充了工程二硫键在抗体Fab域修饰改造的应用研究。通过构建的两个不同的Ig G-sc Fv构型双特异性抗体验证了这两个工程二硫键的引入可显著提升单体含量和回收产量,而不影响抗体的亲和活性,这为双特异性抗体的构建和优化提供新的思路。在优化后的抗GPC3/CD3双特异性抗体基础上,通过体外癌细胞杀伤实验和体内小鼠肿瘤生长抑制实验,该抗体能够有效募集T淋巴细胞特异性杀伤GPC3癌细胞,可作为靶向治疗GPC3阳性肿瘤的药物,具有潜在的临床应用价值。