第一章青少年特发性脊柱侧凸脊柱松质骨组织高通量单细胞转录组学测序分析目的:青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)是最常见的脊柱畸形之一,但至今为止其病因仍不清晰。此前大量的研究发现AIS患者存在骨代谢和骨骼生长发育异常,提示骨骼细胞异常的增殖、分化在AIS的发病过程中发挥了重要作用。本研究通过对AIS脊柱松质骨组织的单细胞转录组学测序从单细胞层面构建AIS骨骼细胞分化发育图谱,并通过对比分析AIS患者与对照组之间细胞分化发育过程的差异,以期探索AIS发生发展过程中潜在的致病机制,为实现AIS的早期分子诊断和病因学治疗提供理论基础。方法:选取合适的AIS和对照组手术患者,术中取适量脊柱松质骨组织。分离消化组织、筛选细胞、构建单细胞悬液,通过t-SNE算法结合标记基因和基因本体功能识别细胞群体、鉴别细胞类型。拟时序分析构建骨骼细胞(成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞)的分化发育轨迹,对比分析AIS组和对照组骨骼细胞分化发育的差异,并通过细胞间通讯分析和细胞内信号通路分析探索与骨骼细胞异常分化发育相关的细胞间互相作用及其可能的下游目标信号通路,系统探索AIS骨骼细胞异常发育的病因学基础。结果:在脊柱松质骨组织内共发现19类不同类型的细胞。对比分析AIS和对照组间骨骼细胞的分化轨迹和细胞间通讯及下游信号通路,相应地提出了AIS的潜在病因有:(1)AIS间充质干细胞MSC-IGFBP5亚群向成骨细胞分化障碍,导致AIS成骨细胞数量减少和骨骼矿化异常,细胞间通讯分析提示MSC-IGFBP亚群细胞与淋巴细胞的互相作用介导间充质干细胞的炎症爆发、增殖分化障碍和免疫逃逸,构成了免疫因素参与AIS成骨细胞分化障碍的病因学基础。(2)AIS软骨祖细胞向软骨细胞的分化障碍,可能源于其与免疫细胞互相作用后HIF-1信号通路异常激活引起细胞能量代谢障碍,因此导致软骨细胞减少并影响脊柱的软骨内成骨。结论:本研究的单细胞转录组学测序分析首次对比分析了AIS与对照组骨骼细胞分化发育谱系的差异,并根据细胞间通讯和下游信号通路分析提出了AIS成骨细胞和软骨细胞分化障碍的潜在免疫学疾病机制,可以为实现AIS的早期分子诊断和病因学治疗提供新的思路。第二章Rho A/ROCK信号通路异常对青少年特发性脊柱侧凸间充质干细胞向软骨细胞分化的影响及其机制研究目的:青少年特发性脊柱侧凸是最常见的脊柱畸形之一,但其致病机制尚不明确。骨骼细胞异常的生长发育在AIS的病因研究中一直备受关注,我们前期研究也发现AIS患者特定的间充质干细胞群体向软骨细胞分化障碍,且细胞内信号通路的对比分析提示AIS患者间充质干细胞内Rho A/ROCK信号通路异常活跃。但目前针对AIS间充质干细胞内Rho A/ROCK通路异常介导软骨细胞分化障碍的研究较少,本研究拟从基因、蛋白、细胞层面系统研究Rho A/ROCK信号通路异常对在AIS间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的调控作用及其分子机制。方法:选取2016年1月至2017年6月在我院手术治疗的30例Lenke 1女性AIS患者(AIS组)和年龄、性别相匹配的30例非脊柱侧凸手术患者(对照组),术中取适量脊柱松质骨行间充质干细胞体外培养并向软骨细胞诱导分化。单细胞转录组测序构建软骨细胞的分化轨迹图谱,比较分析软骨分化障碍AIS间充质干细胞群体与对照组之间细胞内信号通路的差异。蛋白印记检测AIS组与对照组之间Rho A/ROCK通路关键蛋白的表达,综合利用Si RNA干扰、腺病毒转染、应用抑制剂等方法改变间充质干细胞内Rho A/ROCK信号通路活性,体外向软骨细胞诱导培养中在不同时间节点与AIS组和对照组细胞比较分析软骨细胞细胞增殖、免疫荧光染色、分化标志物表达、下游信号通路关键蛋白表达及其磷酸化水平变化。结果:单细胞转录组测序分析发现AIS间充质干细胞内Rho A/ROCK信号通路异常活跃,蛋白印记检测验证有近50%AIS患者Rho A蛋白表达增强,阿尔新兰染色结果提示其软骨细胞分化能力下降。间充质干细胞体外成软骨细胞诱导培养并在不同时间节点对比分析AIS H-Rho A组、对照组、Rho A干扰表达组、Rho A过表达组、应用ROCK蛋白抑制剂组细胞,发现AIS H-Rho A组细胞内Rho A/ROCK信号通路LIMK、cofilin和MLC蛋白磷酸化水平高于对照组,提示AIS间充质干细胞Rho A/ROCK信号通路的异常活跃,软骨细胞甲苯胺蓝染色、CollagenⅡ和F-actin免疫荧光染色强度弱于对照组,提示其向软骨细胞分化水平降低;干扰Rho A表达或者应用ROCK蛋白抑制剂能够部分降低LIMK、cofilin和MLC的磷酸化水平,并提高甲苯胺蓝染色、CollagenⅡ和F-actin免疫荧光染色强度;在对照组干细胞过表达Rho A蛋白可以提高间充质干细胞内LIMK、cofilin和MLC的磷酸化水平的同时降低向软骨细胞分化的能力。结论:AIS间充质干细胞内高表达的Rho A蛋白可能是Rho A/ROCK信号通路过度激活的启动因素,通过增加下游LIMK、cofilin和MLC蛋白磷酸化水平促进肌动蛋白聚合和细胞骨架重组,间充质干细胞内过度激活的Rho A/ROCK信号通路过度激活在软骨细胞分化过程中发挥抑制作用,并可能因此构成AIS间充质干细胞软骨分化障碍的病因,进一步导致脊柱骨骼生长发育异常参与AIS致病过程。第三章青少年特性脊柱侧凸相关脊柱畸形临床研究第一节青少年特发性脊柱侧凸术后双肩失平衡现象:是否可以预测?目的:术后双肩失平衡是青少年特发性脊柱侧凸手术常见的并发症,能够显著影响患者术后形象和手术的满意度,然而目前针对AIS术后双肩失平衡的研究结果互相矛盾,也并未达成共识。本节研究的目的是探索AIS发生术后双肩失平衡的危险因素,并尝试建立一个全新的AIS术后双肩失平衡的预测公式。方法:选取2012年1月-2015年1月在我院行手术治疗的青少年特发性脊柱侧凸患者进行回顾性分析。测量术前、术后以及末次随访时全脊柱正侧位平片和侧屈位平片。根据末次随访双肩影像学高度(RSH)将患者分为双肩失平衡组和双肩平衡组,进行单因素分析(独立样本t检验)和二元Logistic回归分析术后双肩失平衡的危险因素,建立AIS患者术后双肩失平衡预测公式PSI指数,绘制ROC曲线并计算预测阈值。结果:总共114例AIS患者纳入研究,分为双肩失平衡组(RSH≧10mm)60人和双肩平衡组(RSH<10mm)54人。单因素分析发现两组间术前近胸弯Cobb角(P=0.002)、术前近胸弯Cobb角/术前主胸弯Cobb角比值(P=0.004)、术前近胸弯侧屈位Cobb角(P=0.006)、术前胸腰弯/腰弯侧屈位Cobb角(P=0.050)、术后近胸弯Cobb角(P=0.036)、术后近胸弯顶椎偏移(P=0.006)、末次随访近胸弯顶椎偏移(P=0.004)和adding-on角(P=0.004)存在显著的统计学差异。校正的二元Logistic回归显示术后近胸弯顶椎偏移(P=0.035)和Adding-on角(P=0.026)是AIS患者发生术后双肩失平衡的主要危险因素,并成功建立双肩失平衡的预测公式:PSI指数=1.2*术后近胸弯顶椎偏移+1.1*Adding-on角。绘制受试者工作特征(ROC)曲线计算并计算当PSI指数大于15,AIS患者发生双肩失平衡的概率为87%,反之,当PSI指数小于15,术后双肩平衡的概率则达到80%。结论:术后近胸弯的顶椎偏移和Adding-on角是AIS患者发生术后双肩失平衡的主要危险因素。AIS术后双肩失平衡和adding-on现象互为代偿机制以实现脊柱的整体平衡。本研究成功建立起AIS患者术后双肩失平衡的预测公式:PSI指数=1.2*术后近胸弯的顶椎偏移+1.1*Adding-on角,可以有效地预测AIS患者术后双肩失平衡的发生。因此,我们建议应该充分矫正近胸弯的顶椎偏移,同时通过合理选择融合节段等措施减小adding-on角度,从而预防AIS患者发生术后双肩失平衡。第二节Lenke 1型和2型青少年特发性脊柱侧凸患者术后颈椎倾斜现象:一种新的预测方法目的:颈椎倾斜是青少年特发性脊柱侧凸术后常见的影像学并发症,其与双肩失平衡是不同的术后并发症概念,但同样可以对患者外观形象和健康相关生存质量产生较大影响。然而目前AIS术后颈椎倾斜的相关研究较少,结果也并无定论。因此,本研究致力于研究胸弯型(Lenke 1型和2型)AIS患者术后颈椎倾斜的危险因素,并试图探索全新的预测公式以期有效地预测并减少术后颈椎倾斜的发生。方法:回顾性分析2013年2月至2015年2月在我院行手术治疗的Lenke 1型和2型AIS患者,测量患者术前、术后和末次随访的全脊柱正侧位X光平片、侧屈位X光平片。根据术后颈椎轴向倾斜角(CAT)将患者分为颈椎倾斜组和正常组,单因素分析和二元Logistic回归分析术后颈椎倾斜的危险因素,建立Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的预测公式,绘制ROC曲线并计算预测公式的阈值。结果:本研究共纳入102例Lenke 1型和2型AIS患者,根据是否发生术后颈椎倾斜分为颈椎倾斜组41人(CAT≧5°))和正常组61人(CAT<5°)。两组间的单因素分析发现术后T1倾斜角(P=0.003)、术前近胸弯Cobb角(P<0.001)、术后近胸弯Cobb角(P<0.001)、术后近胸弯顶椎偏移(P<0.001)和术后冠状面平衡(P<0.001)是AIS患者发生术后颈椎倾斜的危险因素。二元Logistic回归结果提示术后近胸弯Cobb角(P=0.0019)和术后冠状面平衡(P<0.001)是Lenke 1型和2型AIS患者发生术后颈椎倾斜的主要危险因素,并成功建立了Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的预测公式:PNT指数=1.1*术后近胸弯Cobb角-0.9*术后冠状面平衡。绘制ROC曲线并计算当PNT指数大于10,则Lenke 1型和2型AIS患者发生术后颈椎倾斜的概率为86%,反之,当PNT指数小于10,Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎轴向倾斜角正常的概率则为81%。结论:Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的发生率为40.2%,术后近胸弯Cobb角和术后冠状面平衡是AIS发生术后颈椎倾斜的主要危险因素。本研究成功建立起Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的预测公式:PNT指数=1.1*术后近胸弯Cobb角-0.9*术后冠状面平衡,可以有效地预测Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的发生。据此,我们建议应该尽可能矫正Lenke 1型和2型AIS患者近胸弯的同时适度矫正冠状面平衡,从而预防发生术后颈椎倾斜。