以乳清蛋白为原料,通过酶解法制备抗氧化肽。先使用超滤分离技术对抗氧化肽进行初步分离,并借助5种体外抗氧化试验研究各分离组分的抗氧化活性,筛选出具有最强抗氧化功能的组分,进而研究该组分抗氧化活性的稳定性。在此基础上,进一步采用凝胶层析、离子交换层析和反相高效液相色谱及质谱技术对该组分进行分离纯化及鉴定。研究结果如下:1.比较木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和酸性蛋白酶的酶解效果,以·OH自由基清除率和多肽含量为指标,筛选出中性蛋白酶为最佳酶。通过单因素试验和响应面试验设计,获得制备乳清蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件:pH值为5.50,温度为65℃、时间为1.6 h,底物浓度为5%,酶底比为5 000 U/g。此时酶解液对·OH自由基清除率为74.54?0.95%。2.依次使用10 kDa、5 kDa和3 kDa超滤膜对酶解液进行超滤分离,得到分子量不同的4个组分P-I(>10kDa)、P-II(10~5 kDa)、P-III(5~3 kDa)和P-IV(<3 kDa)。借助5种体外抗氧化试验比较不同超滤组分抗氧化活性。结果表明:对·OH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基清除能力大小为:P-IV>P-III>P-II>P-I;对DPPH自由基清除能力大小为:P-I>P-II>P-IV>P-III;四个组分的还原力差异不显著(P>0.05),P-IV组分表现出最强体外抗氧化活性。3.P-IV组分稳定性研究结果表明:P-IV组分具有较好耐热性和耐酸性,但不耐碱性。NaCl会显著影响P-IV组分的稳定性(p<0.05),紫外线照射时间超过6 h时会显著降低其稳定性(p<0.05)。在25℃下,糖类对其稳定性没有显著影响(p>0.05)。4.Sephadex G-25凝胶层析分离P-IV组分,最佳条件为:以超纯水洗脱,上样量为2.0 mL,流速为0.6 mL/min,此时得到两个峰F1和F2。其中F1的·OH自由基和ABTS自由基清除率均高于F2,选择F1进行再次分离。DEAE-52离子交换层析分离F1,最佳条件为:以1.0 mol/L NaCl洗脱,上样量为2.0 mL,流速为1.5 mL/min,此时得到三个峰F11、F12和F13。其中F13的·OH自由基和ABTS自由基清除率均高于F11和F12,选择F13进行再次分离。反相高效液相色谱分离F13只得到一个峰F131,最后质谱鉴定得到4条抗氧化肽序列:RTPEVDDEALEK、LVRTPEVDDE、ELKPTPEGDL和VIESPPEINT。