论文部分内容阅读
研究背景：
已知胚胎心脏发育早期，来自心外的前体细胞经原始心管动脉端和静脉端不断迁入心内，并在相关转录因子或信号分子的调控下，向工作心肌或传导系心肌分化，参与心脏四腔室及中枢传导系和周围传导系的发育。研究表明第二生心区(SHF)心脏前体细胞可经心背系膜向心管内迁移，参与形成流出道、右心室、部分心房及房间隔、心房背侧间充质突以及主动脉和肺动脉干的发育。胰岛素增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein，Islet-1，Isl-1 )，是SHF前体细胞的标记之一，观察ISL-1阳性细胞的时空分布特征，进而探讨SHF前体细胞的增殖和迁移机制，为研究SHF前体细胞参与心脏早期发育的机制提供了重要的形态学资料。本课题组前期研究发现，小鼠胚胎和人胚胎心脏发育早期，Isl-1可能使SHF间充质细胞维持心肌前体细胞状态，保持一定的增殖和迁移能力，参与动脉囊分隔及升主动脉、肺动脉的发育过程。SHF间充质内可见Isl-1阳性呼吸内胚层与其周围的呼吸内胚层相关Isl-1阳性细胞区(PE-Isl-1F)密切相关，PE-Isl-1F在呼吸内胚层的诱导之下形成特征性的锥体形分布模式。此Isl-1阳性锥体形结构境界清楚，但其周围SHF间充质呈Isl-1阴性表达，因此是否还有其他转录因子调节特征性锥体形结构的形成，以及锥体形结构周围的Isl-1阴性间充质是否参与动脉囊及流出道的发育尚需进一步研究。本课题组前期研究还发现，中枢传导系窦房结原基形成早期呈Isl-1阳性表达，提示窦房结心肌细胞可能来源于静脉端SHF心肌前体细胞，后期在转录因子Tbx3的调控下向起搏细胞分化，逐渐形成功能完善的窦房结。但与窦房结原基相延续的上腔静脉壁间充质则保持Isl-1阴性表达，因此窦房结原基心脏前体细胞的来源仍需进一步探讨。转录因子Tbx3于心管发育早期即表达于房室管，并在房室管及房室结的发育过程中持续表达，并可经静脉瓣迁入窦房结原基，调控其功能发育。但心包腔背侧及前肠周围的SHF间充质亦呈Tbx3阳性，因此SHF间充质前体细胞是否为房室管Tbx3阳性细胞的来源，以及在房室管发育过程中是否持续向其添加细胞尚需进一步探讨。本研究系统观察了Iroquois同源框基因家族的两个成员，Irx1和Irx2在小鼠胚胎和人胚胎心脏发育早期的时空表达模式。第一部分着重观察Irx1和Irx2阳性SHF前体细胞在心管动脉端的时空分布，通过比较Isl-1阳性SHF前体细胞的分布特征，探讨SHF前体细胞参与动脉囊及流出道发育的不同途径。第二部分着重观察Irx1和Irx2阳性SHF前体细胞在传导系发育过程中的分布特征，为研究窦房结起源及房室结和心室传导系的发育提供形态学研究依据。
目的：
观察Irx1和Irx2在小鼠胚胎和人胚胎心脏发育早期的时空表达模式，为探讨Irx1和Irx2阳性SHF前体细胞在心管动脉囊及流出道发育过程以及窦房结起源、房室结和心室传导系发育过程中的作用提供形态学研究依据。
方法：
收集药物流产后保存完好的早期人胚标本及胚龄8天～14天的小鼠胚胎标本制作连续切片进行免疫组织化学染色和免疫荧光染色。选用Isl-1标记第二生心区(SHF)前体细胞、Tbx3标记胚胎心脏中枢传导系统、转录因子Nkx2.5及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)标记发育中的心房和心室心肌细胞，系统观察Irx1和Irx2在心脏发育早期的时空表达模式。
结果：
早在小鼠胚龄8天的心管融合期，前肠内胚层、心包腔背侧脏壁中胚层及心背系膜即可见较强的Irx1与Isl-1阳性表达。小鼠胚龄8.5天～10.5天，Irx1与Isl-1共表达于内胚层腹侧壁及实心细胞团、流出道壁远端及心包腔背侧脏壁中胚层。动脉囊内皮、流出道内皮及内皮下的少量间充质内亦可见Irx1阳性细胞，并与心包腔背侧间充质内的Irx1阳性细胞相延续。小鼠胚龄11天～12天，内胚层细胞呈Irx1及Isl-1双表达阳性，周围间充质形成Irx1与Isl-1双阳性的特征性锥体形结构，尖端突入动脉囊腔，并与流出道远端心肌、心内膜垫延续，参与流出道的分隔。至胚龄13天～14天，流出道分隔成升主动脉和肺动脉干，食管与气管完全分开，仅在气管周围保留少量Irx1阳性细胞。人胚C11～C12期，Irx1及Irx2阳性表达见于内胚层背侧壁及腹侧壁，Isl-1及Nkx2.5阳性表达只见于内胚层腹侧壁。人胚C13～C14期，呼吸内胚层及实心细胞索呈Irx1、Irx2及Isl-1阳性表达，并可辨认特征性的Isl-1阳性锥体形结构，其尖端突入动脉囊腔，进而与流出道远端心胶质延续、融合，参与主、肺动脉隔的发育。心包腔背侧间充质内弥漫性分布的Irx1阳性细胞，亦涌入流出道，在心胶质内弥散分布。人胚C15期，气管腹侧的Isl-1阳性锥体形结构尖端伸入动脉囊，参与形成主、肺动脉隔，将动脉囊分隔成升主动脉与肺动脉干。Isl-1及Irx1双阳性细胞可见于气管壁，并自气管周围间充质向腹侧延伸，肺动脉干壁、升主动脉壁及主、肺动脉隔均可见大量双阳性细胞。Isl-1及Irx2的共表达模式与Isl-1及Irx1的表达模式一致。MHC阴性的流出道壁心肌呈较强的Isl-1、Irx1及Irx2阳性表达，MHC阳性的流出道壁心肌则只显较弱的Isl-1及Irx1阳性。心内膜垫及内皮显Irx1及Irx2阳性，Isl-1表达阴性。人胚C16期，Irx1于食管壁、气管壁及周围间充质中依然表达广泛，并向主、肺动脉隔延伸，包绕升主动脉与肺动脉干。Nkx2.5阳性的流出道心肌，Isl-1及Irx1均呈阴性；流出道心内膜垫显Irx1阳性表达，但Nkx2.5及Isl-1则显阴性表达。
小鼠胚龄8.5天～9.5天，原始心管房室管壁呈Irx1及Tbx3阳性表达，并可见少量双阳性细胞分布，房室管内皮也呈Irx1阳性表达。小鼠胚龄10天～10.5天，右上腔静脉内侧壁局部增厚且呈Isl-1强阳性表达，并与Isl-1强阳性的部分心房背侧壁心肌相延续，窦房结原基逐渐形成。大量强阳性Irx1细胞，自上腔静脉内侧壁延伸至窦房结原基。房室管壁心肌呈Irx1与Tbx3阳性表达，可见部分双阳性细胞。Irx1与Tbx3双阳性细胞自房室管后壁向室间隔延伸，直达心室腹侧壁。小鼠胚龄11天～12天，窦房结原基呈Isl-1及Irx1较强阳性、Tbx3较弱阳性及NKX2.5阴性表达，右上腔静脉壁的Irx1阳性表达亦明显增强，并与窦房结内的Irx1阳性表达相延续。房室管前壁Tbx3表达强于Irx1，房室管侧壁Irx1表达增强，房室管心内膜垫中也可见Irx1表达。房室管后壁，Tbx3阳性表达局限，Irx1强阳性细胞则向腹侧延伸至室间隔心肌。至小鼠胚龄13天～14天，窦房结体积增大，呈Isl-1、Tbx3阳性表达，但Irx1呈阴性表达。左、右静脉瓣可见Irx1及Tbx3阳性细胞分布，并可分辨Irx1及Tbx3阳性表达的房室结。人胚C11～C12期，原始房室管壁显较强的Irx1阳性，原始心房背侧壁则显较强的Irx2阳性表达。人胚C13～C14期，Isl-1表达阳性、Nkx2.5阴性的窦房结原基形成，Irx1于窦房结原基和静脉瓣均呈较强的阳性表达，窦房结原基内部分细胞呈Irx2阳性。房室管壁的Irx1阳性表达增强，房室管心内膜垫及内皮亦呈较强的Irx1及Irx2阳性。Irx1阳性细胞自气管腹侧间充质向心房背侧壁延伸，经左、右静脉瓣、心房背侧间充质突(DMP)与房室管壁心肌及心内膜垫内的Irx1阳性细胞相连。至人胚C15～C16期，窦房结原基内含大量Irx1阳性细胞，其中部分细胞同时表达Isl-1阳性。房室管壁心肌及内、外侧的间充质均呈Irx1阳性表达，但Nkx2.5阳性表达只限于管壁心肌。Irx1阳性细胞自心房顶壁沿房间隔延续至DMP并与房室管心内膜垫相连。Irx2于心房壁、静脉瓣及房间隔显较弱的阳性表达，但于房室管壁、心内膜垫、DMP等处呈阴性表达。
结论
1.Irx1与Irx2在胚胎发育早期表达广泛于不同胚层，且二者与Isl-1的表达部位具有重叠性，支持Irx1、Irx2可能参与包括心脏在内的多种器官的发育过程。
2.Irx1在SHF的时空表达模式与Isl-1极为相似，特征性的Isl-1阳性锥体形结构同时呈Irx1与Isl-1双阳性表达，但Irx1表达范围较Isl-1更加广泛，故推测Irx1是SHF前体细胞广泛表达的转录因子，在某些调节因素作用之下，局部间充质增殖并同时表达Irx1与Isl-1，形成特征性的锥体形结构，进而在前体细胞向心管两端添加的过程中起重要调节作用。
3.Irx1、Irx2阳性SHF前体细胞与动脉囊、流出道的分隔密切相关。在SHF前体细胞持续向流出道远端添加的过程中，Irx1、Irx2可能与Isl-1协同作用，以确定SHF前体细胞的不同分化方向，在动脉囊及流出道分隔的早期阶段，一方面参与升主动脉和肺动脉干壁的发育，另一方面，经主肺动脉隔延伸入流出道心内膜垫，参与流出道的分隔
4.Irx1、Irx2阳性的内胚层细胞与其周围的阳性间充质细胞紧密相邻并且内胚层表达强度高于周围间充质，提示Irx1、Irx2也是内胚层发育分化及内胚层诱导Irx1与Isl-1双阳性SHF前体细胞增殖分化的重要调节因子。
5.Irx1阳性SHF心肌前体细胞可能是窦房结原基的细胞来源，经上腔静脉壁及心背系膜两个途径同时向窦房结原基内添加细胞，并在进入窦房结后共表达Isl-1阳性，共同调控窦房结的形态发生。Irx1在有限时间内参与Tbx3促进前体细胞向起搏心肌分化的过程。
6.房室管心肌的发育呈现异质性。房室管前壁Tbx3表达强于Irx1，在房室管后壁，Irx1强阳性细胞与左上腔静脉壁的Irx1阳性间充质相延续。此外，房室管壁Irx1及Tbx3阳性细胞还参与心室传导系的发育。
7.房室结形态和功能的发育晚于窦房结。窦房结原基Tbx3阳性表达增强，Irx1及Irx2阳性表达消失，只保留发育中的房室结及室间隔顶部的房室束仍可见Irx1阳性细胞分布，提示房室结心肌仍保留前体细胞特性。
已知胚胎心脏发育早期，来自心外的前体细胞经原始心管动脉端和静脉端不断迁入心内，并在相关转录因子或信号分子的调控下，向工作心肌或传导系心肌分化，参与心脏四腔室及中枢传导系和周围传导系的发育。研究表明第二生心区(SHF)心脏前体细胞可经心背系膜向心管内迁移，参与形成流出道、右心室、部分心房及房间隔、心房背侧间充质突以及主动脉和肺动脉干的发育。胰岛素增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein，Islet-1，Isl-1 )，是SHF前体细胞的标记之一，观察ISL-1阳性细胞的时空分布特征，进而探讨SHF前体细胞的增殖和迁移机制，为研究SHF前体细胞参与心脏早期发育的机制提供了重要的形态学资料。本课题组前期研究发现，小鼠胚胎和人胚胎心脏发育早期，Isl-1可能使SHF间充质细胞维持心肌前体细胞状态，保持一定的增殖和迁移能力，参与动脉囊分隔及升主动脉、肺动脉的发育过程。SHF间充质内可见Isl-1阳性呼吸内胚层与其周围的呼吸内胚层相关Isl-1阳性细胞区(PE-Isl-1F)密切相关，PE-Isl-1F在呼吸内胚层的诱导之下形成特征性的锥体形分布模式。此Isl-1阳性锥体形结构境界清楚，但其周围SHF间充质呈Isl-1阴性表达，因此是否还有其他转录因子调节特征性锥体形结构的形成，以及锥体形结构周围的Isl-1阴性间充质是否参与动脉囊及流出道的发育尚需进一步研究。本课题组前期研究还发现，中枢传导系窦房结原基形成早期呈Isl-1阳性表达，提示窦房结心肌细胞可能来源于静脉端SHF心肌前体细胞，后期在转录因子Tbx3的调控下向起搏细胞分化，逐渐形成功能完善的窦房结。但与窦房结原基相延续的上腔静脉壁间充质则保持Isl-1阴性表达，因此窦房结原基心脏前体细胞的来源仍需进一步探讨。转录因子Tbx3于心管发育早期即表达于房室管，并在房室管及房室结的发育过程中持续表达，并可经静脉瓣迁入窦房结原基，调控其功能发育。但心包腔背侧及前肠周围的SHF间充质亦呈Tbx3阳性，因此SHF间充质前体细胞是否为房室管Tbx3阳性细胞的来源，以及在房室管发育过程中是否持续向其添加细胞尚需进一步探讨。本研究系统观察了Iroquois同源框基因家族的两个成员，Irx1和Irx2在小鼠胚胎和人胚胎心脏发育早期的时空表达模式。第一部分着重观察Irx1和Irx2阳性SHF前体细胞在心管动脉端的时空分布，通过比较Isl-1阳性SHF前体细胞的分布特征，探讨SHF前体细胞参与动脉囊及流出道发育的不同途径。第二部分着重观察Irx1和Irx2阳性SHF前体细胞在传导系发育过程中的分布特征，为研究窦房结起源及房室结和心室传导系的发育提供形态学研究依据。
目的：
观察Irx1和Irx2在小鼠胚胎和人胚胎心脏发育早期的时空表达模式，为探讨Irx1和Irx2阳性SHF前体细胞在心管动脉囊及流出道发育过程以及窦房结起源、房室结和心室传导系发育过程中的作用提供形态学研究依据。
方法：
收集药物流产后保存完好的早期人胚标本及胚龄8天～14天的小鼠胚胎标本制作连续切片进行免疫组织化学染色和免疫荧光染色。选用Isl-1标记第二生心区(SHF)前体细胞、Tbx3标记胚胎心脏中枢传导系统、转录因子Nkx2.5及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)标记发育中的心房和心室心肌细胞，系统观察Irx1和Irx2在心脏发育早期的时空表达模式。
结果：
早在小鼠胚龄8天的心管融合期，前肠内胚层、心包腔背侧脏壁中胚层及心背系膜即可见较强的Irx1与Isl-1阳性表达。小鼠胚龄8.5天～10.5天，Irx1与Isl-1共表达于内胚层腹侧壁及实心细胞团、流出道壁远端及心包腔背侧脏壁中胚层。动脉囊内皮、流出道内皮及内皮下的少量间充质内亦可见Irx1阳性细胞，并与心包腔背侧间充质内的Irx1阳性细胞相延续。小鼠胚龄11天～12天，内胚层细胞呈Irx1及Isl-1双表达阳性，周围间充质形成Irx1与Isl-1双阳性的特征性锥体形结构，尖端突入动脉囊腔，并与流出道远端心肌、心内膜垫延续，参与流出道的分隔。至胚龄13天～14天，流出道分隔成升主动脉和肺动脉干，食管与气管完全分开，仅在气管周围保留少量Irx1阳性细胞。人胚C11～C12期，Irx1及Irx2阳性表达见于内胚层背侧壁及腹侧壁，Isl-1及Nkx2.5阳性表达只见于内胚层腹侧壁。人胚C13～C14期，呼吸内胚层及实心细胞索呈Irx1、Irx2及Isl-1阳性表达，并可辨认特征性的Isl-1阳性锥体形结构，其尖端突入动脉囊腔，进而与流出道远端心胶质延续、融合，参与主、肺动脉隔的发育。心包腔背侧间充质内弥漫性分布的Irx1阳性细胞，亦涌入流出道，在心胶质内弥散分布。人胚C15期，气管腹侧的Isl-1阳性锥体形结构尖端伸入动脉囊，参与形成主、肺动脉隔，将动脉囊分隔成升主动脉与肺动脉干。Isl-1及Irx1双阳性细胞可见于气管壁，并自气管周围间充质向腹侧延伸，肺动脉干壁、升主动脉壁及主、肺动脉隔均可见大量双阳性细胞。Isl-1及Irx2的共表达模式与Isl-1及Irx1的表达模式一致。MHC阴性的流出道壁心肌呈较强的Isl-1、Irx1及Irx2阳性表达，MHC阳性的流出道壁心肌则只显较弱的Isl-1及Irx1阳性。心内膜垫及内皮显Irx1及Irx2阳性，Isl-1表达阴性。人胚C16期，Irx1于食管壁、气管壁及周围间充质中依然表达广泛，并向主、肺动脉隔延伸，包绕升主动脉与肺动脉干。Nkx2.5阳性的流出道心肌，Isl-1及Irx1均呈阴性；流出道心内膜垫显Irx1阳性表达，但Nkx2.5及Isl-1则显阴性表达。
小鼠胚龄8.5天～9.5天，原始心管房室管壁呈Irx1及Tbx3阳性表达，并可见少量双阳性细胞分布，房室管内皮也呈Irx1阳性表达。小鼠胚龄10天～10.5天，右上腔静脉内侧壁局部增厚且呈Isl-1强阳性表达，并与Isl-1强阳性的部分心房背侧壁心肌相延续，窦房结原基逐渐形成。大量强阳性Irx1细胞，自上腔静脉内侧壁延伸至窦房结原基。房室管壁心肌呈Irx1与Tbx3阳性表达，可见部分双阳性细胞。Irx1与Tbx3双阳性细胞自房室管后壁向室间隔延伸，直达心室腹侧壁。小鼠胚龄11天～12天，窦房结原基呈Isl-1及Irx1较强阳性、Tbx3较弱阳性及NKX2.5阴性表达，右上腔静脉壁的Irx1阳性表达亦明显增强，并与窦房结内的Irx1阳性表达相延续。房室管前壁Tbx3表达强于Irx1，房室管侧壁Irx1表达增强，房室管心内膜垫中也可见Irx1表达。房室管后壁，Tbx3阳性表达局限，Irx1强阳性细胞则向腹侧延伸至室间隔心肌。至小鼠胚龄13天～14天，窦房结体积增大，呈Isl-1、Tbx3阳性表达，但Irx1呈阴性表达。左、右静脉瓣可见Irx1及Tbx3阳性细胞分布，并可分辨Irx1及Tbx3阳性表达的房室结。人胚C11～C12期，原始房室管壁显较强的Irx1阳性，原始心房背侧壁则显较强的Irx2阳性表达。人胚C13～C14期，Isl-1表达阳性、Nkx2.5阴性的窦房结原基形成，Irx1于窦房结原基和静脉瓣均呈较强的阳性表达，窦房结原基内部分细胞呈Irx2阳性。房室管壁的Irx1阳性表达增强，房室管心内膜垫及内皮亦呈较强的Irx1及Irx2阳性。Irx1阳性细胞自气管腹侧间充质向心房背侧壁延伸，经左、右静脉瓣、心房背侧间充质突(DMP)与房室管壁心肌及心内膜垫内的Irx1阳性细胞相连。至人胚C15～C16期，窦房结原基内含大量Irx1阳性细胞，其中部分细胞同时表达Isl-1阳性。房室管壁心肌及内、外侧的间充质均呈Irx1阳性表达，但Nkx2.5阳性表达只限于管壁心肌。Irx1阳性细胞自心房顶壁沿房间隔延续至DMP并与房室管心内膜垫相连。Irx2于心房壁、静脉瓣及房间隔显较弱的阳性表达，但于房室管壁、心内膜垫、DMP等处呈阴性表达。
结论
1.Irx1与Irx2在胚胎发育早期表达广泛于不同胚层，且二者与Isl-1的表达部位具有重叠性，支持Irx1、Irx2可能参与包括心脏在内的多种器官的发育过程。
2.Irx1在SHF的时空表达模式与Isl-1极为相似，特征性的Isl-1阳性锥体形结构同时呈Irx1与Isl-1双阳性表达，但Irx1表达范围较Isl-1更加广泛，故推测Irx1是SHF前体细胞广泛表达的转录因子，在某些调节因素作用之下，局部间充质增殖并同时表达Irx1与Isl-1，形成特征性的锥体形结构，进而在前体细胞向心管两端添加的过程中起重要调节作用。
3.Irx1、Irx2阳性SHF前体细胞与动脉囊、流出道的分隔密切相关。在SHF前体细胞持续向流出道远端添加的过程中，Irx1、Irx2可能与Isl-1协同作用，以确定SHF前体细胞的不同分化方向，在动脉囊及流出道分隔的早期阶段，一方面参与升主动脉和肺动脉干壁的发育，另一方面，经主肺动脉隔延伸入流出道心内膜垫，参与流出道的分隔
4.Irx1、Irx2阳性的内胚层细胞与其周围的阳性间充质细胞紧密相邻并且内胚层表达强度高于周围间充质，提示Irx1、Irx2也是内胚层发育分化及内胚层诱导Irx1与Isl-1双阳性SHF前体细胞增殖分化的重要调节因子。
5.Irx1阳性SHF心肌前体细胞可能是窦房结原基的细胞来源，经上腔静脉壁及心背系膜两个途径同时向窦房结原基内添加细胞，并在进入窦房结后共表达Isl-1阳性，共同调控窦房结的形态发生。Irx1在有限时间内参与Tbx3促进前体细胞向起搏心肌分化的过程。
6.房室管心肌的发育呈现异质性。房室管前壁Tbx3表达强于Irx1，在房室管后壁，Irx1强阳性细胞与左上腔静脉壁的Irx1阳性间充质相延续。此外，房室管壁Irx1及Tbx3阳性细胞还参与心室传导系的发育。
7.房室结形态和功能的发育晚于窦房结。窦房结原基Tbx3阳性表达增强，Irx1及Irx2阳性表达消失，只保留发育中的房室结及室间隔顶部的房室束仍可见Irx1阳性细胞分布，提示房室结心肌仍保留前体细胞特性。