猪β-防御素-2对黄曲霉毒素B1致肠道损伤的修复效果研究

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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是毒性最强的霉菌毒素,可严重损伤动物肠道,对动物健康和养殖业造成严重影响;防御素是动物自身产生的天然抗菌肽,具有修复机体损伤和增强免疫力的作用。为探究猪β-防御素-2(Porcineβ-defensin 2,p BD-2)对AFB1致肠道损伤的修复作用,以IPEC-J2细胞及KM小鼠为模型,使用CCK-8法筛选AFB1及p BD-2的可用浓度,再通过q PCR确认不同浓度AFB1对IPEC-J2细胞的影响,建立AFB1致细胞损伤模型。然后以不同浓度p BD-2处理细胞损伤模型,使用q PCR、Western Blot、ROS荧光染色及流式细胞术等方法,探究p BD-2对AFB1致细胞损伤的修复作用。动物试验使用AFB1处理SPF级KM小鼠,建立AFB1致小鼠损伤模型,再使用p BD-2处理小鼠损伤模型,通过制作石蜡切片并进行HE染色及免疫荧光染色,探索p BD-2对AFB1致小鼠肠道损伤的修复效果。结果显示:细胞试验上,60 mg/L及更高剂量AFB1可使细胞存活率显著降低(P<0.05);p BD-2在10 mg/L出现细胞毒性,细胞存活率显著降低(P<0.05)。因此使用低于60 mg/L梯度浓度的AFB1处理细胞,检测细胞因子及ROS的变化,发现AFB1在30 mg/L时对细胞影响最明显(P<0.05),后续以此浓度建立AFB1致细胞损伤模型。使用不同浓度p BD-2处理细胞损伤模型,结果可见2、4 mg/L p BD-2可显著缓解AFB1对细胞凋亡的诱导作用;4、6 mg/L p BD-2可显著缓解AFB1造成的炎症反应,修复AFB1对紧密连接造成的破坏,恢复MUC2的表达,保护肠黏膜屏障(P<0.05);6 mg/L p BD-2可有效清除AFB1导致的ROS积累,缓解氧化损伤。动物试验上,AFB1可显著降低小鼠平均日增重(P<0.05),使用p BD-2继续处理后有显著恢复(P<0.05)。HE染色发现AFB1导致小鼠空肠黏膜显著损伤,嗜酸性增强,并伴有严重的肠壁变薄,肠绒毛萎缩、稀疏,肠绒毛高度与隐窝深度之比、相对肠绒毛数量及肠壁厚度受AFB1影响均显著降低(P<0.05),使用p BD-2处理小鼠损伤模型,肠道结构可见显著恢复(P<0.05)。免疫荧光结果表明,受AFB1影响,空肠黏膜上皮发生炎症反应及细胞凋亡,紧密连接及肠黏膜屏障环境稳态受损,使用p BD-2继续处理,上述损伤显著恢复(P<0.05)。综上,本研究结果表明,AFB1可对IPEC-J2细胞及小鼠空肠黏膜上皮造成严重影响,引发炎症反应和氧化损伤,并促进细胞凋亡,破坏紧密连接,对肠黏膜上皮造成损害,并影响机体消化吸收功能,降低小鼠免疫力及日增重;p BD-2可通过调控细胞因子及蛋白的表达缓解AFB1对小肠上皮细胞造成的影响,减少ROS积累,并可修复肠黏膜上皮结构,改善肠道内环境及肠黏膜屏障。
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