半夏作为药用植物有着很高的经济价值,且体内拥有大量的内生菌资源。内生菌可促进植物生长,还含有丰富的抗性基因,因此研究半夏内生菌对半夏的栽培有着重要意义。抗生素由于其防效快,因此在农业生产上被广泛使用,但其产生的耐药性问题已不容忽视。抗菌肽凭借不易产生耐药性且具有天然抗菌活性等优点成为抗生素的潜在替代品,有着良好的发展前景。本研究从半夏植株内分离得到163株内生细菌和53株内生真菌,利用其与不同病原菌进行平板对峙培养,筛选到13株内生细菌和6株内生真菌拮抗效果较强,其中编号F23的内生真菌拮抗效果最为显著。通过形态学鉴定和分子鉴定确定其为棕黑腐质霉（Humicola fuscoatra）。本研究通过我们课题组建立的指示菌内置文库抗性基因筛选技术,以棕黑腐质霉作为原材料,使用枯草芽胞杆菌高效分泌表达系统建立棕黑腐质霉c DNA文库。以菌株出现自溶现象为筛选标准,对文库中4336株菌株进行筛选,得到61株能够稳定自溶的单克隆菌株。再使用硫酸铵沉淀法提取它们的胞外粗蛋白,使用5种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作为靶标菌对其进行抑菌效果分析,筛选出抗菌效果明显且稳定的抗菌肽Hf R3283和Hf R3877做进一步的抗菌肽活性研究。研究结果表明抗菌肽Hf R3283和Hf R3877在不同条件的紫外处理和温度处理下抑菌效果保持稳定,而在测定经过不同的生物酶处理后抗菌肽Hf R3283和Hf R3877抑菌效果的实验中,结果表明在脂肪酶和蛋白酶E的影响下其仍能保持稳定的抑菌效果。由此可知抗菌肽Hf R3283和Hf R3877具有良好的理化性质,可以做进一步的研究。本研究利用Ni-NTA加蛋白TEV酶标签纯化抗菌肽Hf R3283和Hf R3877,将得到的产物进行SDS-PAGE电泳,电泳结果与预测大小基本一致,分别为13.8 k Da和21.5 k Da。以多粘菌素B作为阳性对照,使用纯化后的Hf R3283和Hf R3877蛋白进行最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）测定,结果表明抗菌肽Hf R3283的MIC值位于10.0-18.2μg/m L区间,抗菌肽Hf R3877的MIC值位于13.8-20.0μg/m L区间,这两种抗菌肽在极低的浓度下对4种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出显著的抑菌活性。随后将抗菌肽Hf R3283和Hf R3877与5种病原真菌进行对峙培养,发现抗菌肽Hf R3283和Hf R3877对5种病原真菌菌丝的生长均表现出显著的抑制作用,并且我们使用5×MIC浓度下的抗菌肽Hf R3283和Hf R3877处理猪的血红蛋白,结果表明其溶血率均不足1%。由此可以证明抗菌肽Hf R3283和Hf R3877不仅有广谱的抗性且安全性良好。为了对抗菌肽Hf R3283和Hf R3877的抑菌机制进行研究,我们将使用抗菌肽Hf R3283和Hf R3877处理过的水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）和番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis）细胞在扫描电镜下进行观察,发现经抗菌肽Hf R3283和Hf R3877处理后的这两种病原菌细胞表面均出现畸形、皱缩甚至破裂的现象,而以PBS缓冲液为对照处理下的这两种病原菌的细胞表面光滑无损伤,由此可以证明抗菌肽是通过损伤细菌细胞膜来实现抑菌活性。为了测试抗菌肽Hf R3283和Hf R3877在活体植株上的防治效果,我们将多粘菌素B处理后的病原菌接种到番茄植株上作为阳性对照,将PBS缓冲液处理后的病原菌接种到番茄植株上作为阴性对照,结果表明接种了抗菌肽Hf R3283和Hf R3877处理后的病原菌的番茄植株生长正常无明显病症。综上所述,本研究从半夏植株中分离到163株内生细菌和53株内生真菌。然后利用枯草芽胞杆菌高效分泌表达系统建立了棕黑腐质霉c DNA文库,并从中筛选得到两个新型且具广谱抑菌活性的抗菌肽Hf R3283和Hf R3877,它们具有稳定的理化性质且相对安全,并且对活体番茄植株也具有良好的抑菌活性。