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世界范围的细菌耐药性呼吁新的抗菌策略,低强度激光或单色光(lowintensity laser irradiation or monochromatic light,LIL)对免疫功能的康复是候选手段之一。中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)是体内抗菌的第一道防线,主要采用呼吸爆发(respiratory burst)和形成胞外杀菌网(neutrophil extracellular traps,NETs)两种方式杀菌,而且后者的杀菌功能比前者强。建立PENs相关模型,考察LIL对其杀菌功能的调节,对于将光疗这种更安全有效的抗菌新疗法推广应用到普罗大众及运动员这个用药更需谨慎及受到诸多限制的特殊人群中具有十分重要的意义。
感染性疾病引起的死亡在所有死亡原因中全球排第二,在发达国家排第三。细菌或真菌等病原微生物感染会吸引PMNs、肥大细胞和巨噬细胞等天然免疫细胞,并进一步激发适应性免疫反应,引起炎症。只有当病原微生物被杀死之后,炎症才会逐渐康复。因此,对于感染的治疗或炎症的康复,杀菌始终是第一位的。现代医学的重点在利用抗生素杀菌。遗憾的是,病原微生物的抗生素抵抗性逐渐增加,而抗生素本身的发展却逐年下降,人们不得不寻找新的杀菌策略。不但抗生素的滥用会通过益生菌耐药基因的捕获促使病原菌形成耐药性,即便是抗生素的合理使用会促使病原菌形成耐药性。鉴于抗生素的特异性和耐药性,在使用抗生素之前需要查明所感染的细菌、真菌或衣原体等微生物种类。检验需要时间,细菌的毒力因子会加强抑制免疫功能,造成病情的恶化。LIL能通过康复PENs的功能来增强杀菌作用,不依赖于细菌的种类。在等待检验结果的时间段,建议采用LIL治疗。即使检验结果出来,面对耐药性很强的菌种,抗生素的选择非常有限,尤其是落后或边缘地区,仍然可以建议采用LIL治疗。对于有广泛耐药性的结核病等疾病,LIL更应该成为首选。LIL治疗没有副作用,不会形成耐药性,而且成本很低,值得开展广泛的临床研究。我们之前的工作已经证实了LIL促进PMNs呼吸爆发的信号转导通路,现在需要研究LIL和PMNs的另一重要杀菌方式一生成NETs的关系,以及进一步研究具体的用光剂量。
本研究选择人外周血中性粒细胞,用外源性地塞米松(dexamethasone,DEX)模拟炎症环境下PMNs的功能低下从PMNs的角度建立了炎症的ex vivo细胞模型(ex vivo PMN model of inflammation,ePMI)。本实验研究了发光二极管640±15nm红光(red light at640±15 nm from light emitting diode array,RLED640)对相应细胞模型的光生物调节作用及其可能的机制。实验结果揭示,100mU/ml终浓度的葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,Go)为有效刺激中性粒细胞NADPH氧化酶依赖性和非依赖性生成NETs的最适浓度。地塞米松能显著的抑制中性粒细胞功能,减少NETs的生成,1μmol./ml的DEX抑制NETs生成的效果最好,可以用来成功的建立炎症的ex vivo细胞模型。光照能恢复DEX对中性粒细胞的生成NETs的抑制作用,0.4mW/cm2的RLED照射150秒就可以使NETs的量恢复到接近正常中性粒细胞的水平,恢复其功能内稳态(function-specifichomeostasis,FSH)。除此以外,0.4mW/cm2的RLED照射150秒也可以诱导不受DEX抑制的PMNs生成NETs,但效果不如最适浓度GO的诱导效果,其机制有待进一步研究。实验还发现,秋水仙素造成的微管解聚有利于中性粒细胞生成NETs,SIRT2这种NAD+依赖的组蛋白去乙酰基转移酶降低微管的稳定性,提示SIRT2可能和中性粒细胞NETs生成机制有关。我们的实验验证了这一假设,因为我们发现运动员的SIRT2表达量高于普通人,相应的运动员的中性粒细胞在相同的条件下生成的NETs量比普通人的高。另外,我们发现0.4mW/cm2的RLED照射150秒可以恢复被抑制的SIRT2表达,这提示我们微管在中性粒细胞生成NETs的机制中具有重要的作用,而SIRT2可能就是RLED光照促进中性粒细胞NETs形成的具体作用靶点。进一步实验发现各类人群中各组不同处理方法的光照组的SIRT2含量都要比其对应的无光照组强支持了这一推测。
另外,我们发现普通女生的SIRT2含量高于普通男生,而SIRT2与卡路里限制有关,卡路里限制可以延长寿命,推测S1RT2可能是女性平均寿命高于男性的因素之一。男运动员的SIRT2的含量高于普通男生,提示运动可能可以通过提高SIRT2表达增加NETs的生成,提高免疫力。
另外我们还发现300 J/m2的RLED光照对普通人的中性粒细胞呼吸爆发有双向调节作用,50-300 J/m2剂量的RLED照射能使运动员中性粒细胞呼吸爆发作用受到明显的光生物作用的双向调节。
本实验用外源性地塞米松(dexamethasone,DEX)模拟炎症环境下PMNs的功能低下从PMNs的角度建立了炎症的ex vivo细胞模型,发现了RLED光照促进中性粒细胞胞外杀菌网络形成的现象及其部分可能的机制。我们还尝试寻找了RLED调节中性粒细胞杀菌功能的具体有效剂量,为LIL对免疫功能的康复的疗法的应用打下坚实的基础。