第一部分自噬在大鼠椎间盘组织和髓核细胞中的表达及作用目的:检测自噬在体内椎间盘组织及体外培养的大鼠髓核细胞中的表达情况,探索自噬在椎间盘组织退变和髓核细胞存活中的作用;方法:1.制作大鼠腰椎动静力失稳模型造成大鼠腰椎间盘退变,并在术后9个月通过X线、HE染色、番红O/固绿染色、天狼星红染色等验证退变模型,使用免疫组化、Western Blot方法检测自噬标志物LC3、Beclin-1在正常及退变椎间盘的表达水平;TUNEL法检测正常及退变椎间盘的凋亡指数;2.体外分离培养大鼠髓核细胞,血清剥夺(0%FBS)模拟体内椎间盘的低血供状态,通过透射电镜检测自噬体,AO、Lysotracker Red、MDC染色检测细胞溶酶体活性,WesternBlot检测自噬标志蛋白LC3、Beclin-1的表达,流式细胞术检测自噬率等方法来评估髓核细胞的自噬水平;以及通过流式细胞术检测凋亡率,Western Blot检测凋亡标志蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达来评估凋亡水平;最后通过自噬抑制剂(Wortmannin)抑制血清剥夺后细胞自噬的激活或联合使用自噬激动剂(Rapamycin)诱导过度自噬,根据髓核细胞凋亡水平的变化来探索自噬与凋亡的关系。结果:1.大鼠腰椎动静力失稳模型在术后9个月的X线表现为腰椎曲度变直,终板钙化融合、椎间隙狭窄甚至完全消失;组织形态染色显示椎间隙变窄,纤维环排列紊乱并出现裂隙,髓核细胞外基质的蛋白多糖、II型胶原含量明显减少,终板内层出现大量的软骨陷窝;免疫组化及Western Blot检测显示LC3和Beclin-1在重度退变的大鼠椎间盘组织的表达水平明显低于正常椎间盘组织内的表达水平,而TUNEL染色结果显示凋亡细胞在退变的椎间盘组织中明显增多;2.体外培养的大鼠髓核细胞在有血清的条件下,自噬水平较低;血清剥离12小时即可明显诱导细胞自噬,持续血清剥离48小时后髓核细胞的自噬水平达到最高峰,随后开始下降;而髓核细胞的凋亡在血清剥离24小时后才开始出现,之后细胞的凋亡率随着血清剥离时间的延长而逐渐上升;当血清剥离诱导的正常细胞自噬被Wortmannin抑制后,细胞凋亡率明显上升;当使用Rapamycin进一步提高血清剥离细胞的自噬水平后,细胞凋亡率也明显上升。结论:1.腰椎动静力失稳术后9个月可导致大鼠腰椎间盘重度退变;重度退变大鼠椎间盘组织的自噬水平与正常椎间盘相比有明显下降,而凋亡水平显著提升;自噬水平的下降或失代偿可能是导致椎间盘细胞凋亡以及椎间盘组织退变的原因;2.体外正常培养的髓核细胞的自噬水平较低,血清剥夺可进一步诱导自噬的发生;自噬对髓核细胞在血清剥夺下的存活具有双重作用:适度自噬可抵抗凋亡,有助于细胞的存活;而自噬的过度激活又会进一步促进细胞的死亡。第二部分 低氧对大鼠髓核细胞自噬和凋亡的影响目的:研究低氧对大鼠髓核细胞自噬的影响及其在椎间盘髓核细胞存活中的作用;方法:分离培养大鼠髓核细胞,分别在给与血清(10%FBS)或血清剥夺(0%FBS)条件下将细胞置于低氧(2%O2)或常氧(20%O2)培养箱中培养48小时,通过检测自噬标志蛋白LC3、Beclin-1的表达水平及溶酶体活性来评估低氧对髓核细胞自噬水平的影响;通过抗氧化剂NAC抑制活性氧自由基(ROS)的生成来探索低氧对髓核细胞自噬的调节机制;检测血清剥夺48小时条件下,髓核细胞在低氧或常氧下的凋亡率,并随后通过应用Wortmannin或Rapamycin来抑制自噬或过度激活自噬,检测此时髓核细胞在低氧或常氧中的凋亡率,从而探索低氧对自噬的调节在髓核细胞生存中的作用。结果:无论是给与血清还是血清剥夺,大鼠髓核细胞在低氧条件下的自噬水平都明显低于其在常氧条件下的自噬水平;髓核细胞在低氧条件下的ROS含量也明显低于其在常氧条件下的ROS含量;应用NAC抑制ROS的生成后,髓核细胞的ROS含量和自噬水平都明显下降,且二者在常氧和低氧条件下都无明显差异;低氧条件下的髓核细胞在血清剥夺48小时后的凋亡率要明显低于常氧条件下髓核细胞的凋亡率;当血清剥离诱导的正常细胞自噬被Wortmannin抑制后,髓核细胞的自噬率和凋亡率在低氧或常氧条件下无明显差异;当Rapamycin诱导血清剥离的髓核细胞过度自噬时,低氧条件下髓核细胞的自噬率和凋亡率都要显著低于常氧下髓核细胞的自噬率和凋亡率。结论:单纯低氧不能诱导髓核细胞自噬,反而对髓核细胞的自噬水平有一定的下调作用;髓核细胞自噬水平的调节依赖于细胞内的ROS,低氧通过抑制髓核细胞的ROS的产生来下调自第二部分低氧对大鼠髓核细胞自噬和凋亡的影响噬水平;低氧比常氧更有利于髓核细胞的存活,通过降低细胞的过度自噬来减少长期血清剥夺引起的髓核细胞凋亡。第三部分 氧化应激对大鼠髓核细胞自噬和凋亡的影响目的:研究氧化应激对大鼠髓核细胞自噬和凋亡的影响及其机制,探索自噬和凋亡在氧化应激条件下的相互关系;方法:分离培养大鼠髓核细胞,通过应用H2O2模拟氧化应激状态,检测H2O2作用后髓核细胞凋亡和自噬的变化;并通过检测caspase-9活性,线粒体膜电位,Bcl-2、Bax的蛋白表达来探索凋亡的激活途径;检测MAPKs信号通路(ERK、JNK、p38)的激活,并使用特异性抑制剂来探索自噬激活的信号通路;通过检测细胞自噬被抑制后凋亡水平的变化,探索氧化应激状态下自噬与细胞凋亡之间的关系。结果:大鼠髓核细胞的生存率随着H2O2作用浓度的增加和作用时间的延长而逐渐下降,400μM的H2O2作用24小时即可使大约一半的髓核细胞死亡;流式细胞术和Hoechst 33258染色结果显示,髓核细胞的凋亡率随H2O2作用时间的延长而逐渐升高;H2O2引起caspase-3和caspase-9的激活,降低细胞的线粒体膜电位,并促进Bax、Bcl-2的蛋白表达;H2O2可很快诱导髓核细胞的自噬,表现为GFP-LC3蛋白的聚集,LC3-II/I比例的提高;通过Bafilomycin A1进一步验证了自噬潮的发生;H2O2同时激活MAPKs(ERK、JNK、p38)的蛋白磷酸化,但仅ERK的特异性抑制剂U0126能够降低LC3-II/I;使用Bafilomycin A1和U0126抑制H2O2引起的自噬后,髓核细胞的凋亡率下降,同时线粒体膜电位上升。结论:氧化应激通过线粒体凋亡途径诱导髓核细胞凋亡;同时氧化应激通过激活ERK信号通路诱导髓核细胞自噬;氧化应激引起的髓核细胞凋亡部分依赖于自噬的激活,抑制自噬可减少氧化应激引起的细胞凋亡。