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PKR(double-stranded RNA dependent protein kinase)作为一种依赖 dsRNA 的、干扰素诱导的蛋白激酶,在抗病毒、免疫应答和细胞凋亡等方面发挥着其重要作用。哺乳动物PKR在没有dsRNA的情况下也能被激活。一种PKR激活子,PACT(PKR activator),也被称为RAX(PRKRA相关蛋白X),可以激活PKR。近年来,随着对鱼类干扰素系统的认识不断加深,鱼类PACT、PKR也在逐渐被克隆和鉴定。然而,对于鱼类PACT的功能,人们了解的还是不多。在本实验室以前的工作中,我们证明草鱼(Ctenopharyngodon idella)的PACT参与了 IRF2和ATF4介导的应激通路。在本研究中,我们使用LPS作为刺激源,刺激草鱼CIK细胞后,荧光定量PCR检测草鱼PACT(CiPACT)和PKR(CiPKR)的mRNA表达量。结果显示,CiPACT和CiPKR的mRNA表达量都显著上升,这也说明CiPACT和CiPKR在LPS刺激诱导的先天免疫反应中可能发挥着一定的作用。其中,CiPACT的响应时间比CiPKR更早,提示它们可能存在先后次序。为了探究CiPACT发挥的生理功能,我们分别在草鱼CO细胞中过表达CiPACT,然后分别提取细胞的总蛋白,分析核质蛋白的比例,western blot分析eIF2α的磷酸化水平变化和Cip65的入核变化。结果证明,过表达CiPACT可显著提高eIF2α的磷酸化水平,并且能诱导Cip65从细胞质逐渐向细胞核转移。相反,如果敲降CiPACT则会抑制eIF2α的磷酸化和Cip65的核易位。这些结果表明,CiPACT可以诱导细胞凋亡和激活NF-κB。Bcl-2促进细胞存活,而Bax则促进细胞死亡,这两个基因是细胞凋亡的重要指标。在本研究中,为了检测细胞凋亡,我们通过荧光定量PCR检测了不同条件下CiBcl-2和CiBax的mRNA表达量。实验证明:过表达CiPACT后,CiBcl-2的mRNA表达量下降,而CiBax的mRNA表达量上升;敲降CiPACT后,CiBcl-2和CiBax的mRNA表达量与过表达CiPACT实验组结果正好相反。这说明了CiPACT能够诱导细胞进入凋亡程序。为了进一步了解鱼类PACT作用的分子机制,我们将重组质粒FLAG-tagged CiPACT与GFP-tagged CiPKR共转入HEK-293T细胞中,共免疫沉淀(CO-IP)实验分析证明CiPACT和CiPKR能够发生相互作用。另外,我们还在CO细胞中过表达 pcDNA3.1-CiPACT,利用广谱性 Anti-Ser/Thr/Tyr 磷酸化抗体,western blot检测分析CiPKR是否发生磷酸化变化。结果表明,过表达CiPACT及其CiPACT和CiPKR的相互作用使CiPKR发生磷酸化。因此,鱼类PACT可能有两种方式诱导细胞凋亡:一方面PACT激活PKR,从而导致eIF2α的磷酸化水平上升促进细胞凋亡;另一方面,PACT直接激活凋亡相关的蛋白Bax从而诱导细胞进入凋亡程序。另外,PACT能够激活NF-κB,使细胞能够表达一系列的炎性因子参与免疫反应。在PACT行使功能的过程中,PKR都起着非常重要的桥梁作用。