论文部分内容阅读
胃癌（GC）目前在全球癌症发病率中排名第四,是常见的癌症类型之一。DNA甲基化是人体内重要的表观遗传修饰途径,其在基因表达调控中发挥着关键作用。启动子Cp G岛甲基化通常会导致基因转录受阻,是导致抑癌基因表达缺失的一种重要机制。大量研究表明,基因的甲基化参与了胃癌的发生、发展,这些研究拓展了胃癌发生机制的研究方向,同时也激发了研究者们从甲基化层面来研究如何抑制肿瘤发展的想法。大麻素受体相互作用蛋白1（CNRIP1）可与内源大麻素系统（ECS）的成员G蛋白偶联受体大麻素受体1（CNR1）的C末端相互作用。近年来的研究表明,CNRIP1基因在包括结肠癌、肺癌等在内的多种癌症中均发生不同程度的甲基化,结肠癌细胞中CNRIP1去甲基化后可降低结肠癌细胞的增殖和迁移能力,与此同时,CNR1作为其互作蛋白,已在多项与癌症的相关研究中展示出其抑癌作用,但其二者在胃癌中是否具有相同作用尚未见报道,且其二者之间的作用机制仍待进一步研究。因此,揭示CNRIP1和CNR1对胃癌的发生与发展是如何影响及其二者间的互作机制对阐释胃癌发生的可能分子机制及胃癌的诊断及临床治疗均具有重要意义。本实验通过生信分析,探究CNRIP1基因在胃癌中表达和甲基化及与临床特征的相关性;通过构建CNRIP1过表达胃癌细胞株,研究CNRIP1对胃癌细胞生物学功能（增殖、凋亡、侵袭能力等）的影响;通过构建CNR1过表达及沉默胃癌细胞株,研究CNR1对胃癌细胞生物学功能（增殖、凋亡、侵袭能力等）的影响;通过染色质免疫共沉淀、PKA激酶检测及蛋白免疫印迹等实验,探究CNRIP1-CNR1的互作对胃癌细胞生物学功能的影响,并分析其激活胃癌细胞大麻素受体系统的可能分子机制。第一部分CNRIP1基因在胃癌组织中异常甲基化及异常表达目的利用生物信息学工具,通过对TCGA数据库中原发性胃癌的数据进行分析,筛选出在胃癌中高甲基化低表达的基因,通过免疫组化验证其在胃癌组织中的表达,通过基因集富集分析探究CNRIP1调控胃癌的可能通路。方法1.下载TCGA数据库中原发性胃癌数据,进行m RNA差异分析,筛选出胃癌组织中的差异表达基因。2.通过TCGA数据库下载胃癌甲基化数据,分析差异甲基化的基因并且筛选高甲基化的基因。3.对胃癌组织中差异表达并异常甲基化基因进行GO及KEGG分析,并构建关键差异基因的蛋白互作网络。4.通过皮尔森相关性分析计算TCGA中胃癌组织中CNRIP1表达水平与其甲基化水平的相关性。5.通过免疫组化及MS-PCR检测胃癌组织中CNRIP1的表达水平及甲基化水平。6.通过基因集富集分析找到CNRIP1显著上调和下调的基因集中最显著的通路。结果1.对TCGA数据库中胃癌及正常组织中m RNA进行差异分析得到上调基因7660个,下调基因3492个,对甲基化数据进行差异分析得到高甲基化基因464个,低甲基化基因284个。将低表达数据集与高甲基化的数据集的差异基因取交集,得到86个高甲基化低表达的候选关键基因。2.通过STING数据库构建蛋白质相互作用网络并分析筛选出的差异表达基因,度值排名前十的候选基因为:SST、KCNQ5、NRP2、GFOD1、PRKCB、CNRl P1、ATP1B2、DTNA、MME、GRl A1。3.对CNRIP1在正常胃组织和胃癌组织中的表达进行分析,结果表明胃癌组织中CNRIP1的表达显著低于正常胃组织（P＜0.001）。4.相关性分析结果表明CNRIP1的甲基化与其在胃癌组织中的表达水平呈明显负相关性（COR=-0.471,P＜0.001）。小结CNRIP1在胃癌组织中的表达显著低于正常组织,且其甲基化与表达水平呈明显负相关性,CNRIP1低表达可能与胃癌的早期发生有关。第二部分CNRIP1抑制胃癌的增殖、侵袭和迁移目的通过构建CNRIP1过表达细胞株,通过荧光定量PCR及Western blot实验鉴定CNRIP1过表达细胞株,并利用CCK-8、Ed U、Transwell、划痕等实验技术检测CNRIP1对胃癌细胞生物学功能（包括细胞增殖、侵袭、迁移等）的影响。方法1.通过RT-qPCR检测不同肿瘤细胞株的CNRIP1的表达水平,并挑选CNRIP1表达量最低的胃癌细胞株进行CNRIP1过表达细胞株构建。2.通过CRISPR-Cas9技术构建CNRIP1过表达胃癌细胞系并通过RT-qPCR技术检测CNRIP1的表达水平,验证过表达细胞系构建成功。3.采用CCK-8细胞活力检测,检测CNRIP1过表达细胞株的细胞活力。4.通过Ed U检测法,对CNRIP1过表达细胞株的增殖情况进行检测。5.通过划痕实验,检测CNRIP1过表达细胞株的迁移能力。6.通过Transwell实验,检测CNRIP1过表达细胞株的侵袭能力。结果1.RT-qPCR结果表明在本实验所选择的7个不同的胃癌细胞株中,BGC-803细胞株中CNRIP1表达量最低。2.通过RT-qPCR检测构建的CNRIP1过表达胃癌细胞株,结果显示,细胞株中CNRIP1的表达量显著高于对照组细胞（P＜0.001）,即过表达胃癌细胞株构建成功。3.CCK-8结果显示,CNRIP1过表达细胞株在96小时的OD450值显著低于对照组细胞的OD450值（P＜0.001）。4.Ed U结果显示,CNRIP1过表达细胞株的细胞增殖数与对照组相比,显著降低。5.细胞划痕实验结果显示,CNRIP1过表达细胞的划痕宽度在48 h后显著大于对照组（P＜0.001）。6.Transwell结果显示,CNRIP1过表达组的跨膜细胞数显著少于对照组（P＜0.01）。小结过表达CNRIP1抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。第三部分CNRIP1基于CNR1调节肿瘤细胞的生物学功能目的本部分实验主要通过构建CNR1过表达及沉默细胞株并利用荧光定量PCR及Western blot实验鉴定细胞株的构建,通过CCK-8、Ed U、Transwell、划痕等实验检测CNR1对胃癌细胞生物学功能（包括细胞增殖、侵袭、迁移等）的影响。方法1.通过RT-qPCR及Western blot技术检测BGC-803 CNRIP1过表达（CNRIP1 OE）胃癌细胞株中CNR1 m RNA及蛋白的表达水平。2.通过RT-qPCR检测不同肿瘤细胞株的CNR1的表达水平,挑选CNR1表达量最低的胃癌细胞株进行CNR1过表达细胞株构建,并挑选CNR1表达量较高的胃癌细胞株进行CNR1沉默细胞株构建。3.通过CRISPR-Cas9技术构建CNR1过表达及沉默胃癌细胞系,并将BGC-803 CNRIP1 OE细胞株中CNR1过表达及沉默,将并通过RT-qPCR技术检测CNR1的表达水平,验证细胞系构建成功。4.采用CCK-8细胞活力检测,检测CNR1过表达细胞株的细胞活力。5.通过Ed U检测法,对CNR1过表达细胞株的增殖情况进行检测。6.通过划痕实验,检测CNR1过表达细胞株的迁移能力。7.通过Transwell实验,检测CNR1过表达细胞株的侵袭能力。8.通过裸鼠荷瘤实验,验证CNRIP1及CNR1对体内胃癌肿瘤细胞生长的影响。结果1.RT-qPCR结果表明BGC-803 CNRIP1 OE胃癌细胞株中CNR1 m RNA及蛋白的表达水平无明显变化。2.RT-qPCR结果表明在本实验所选择的7个不同的胃癌细胞株中,AGS细胞株中CNR1表达量最低,MGC-803细胞株中CNR1表达量最高。3.RT-qPCR检测构建的CNR1过表达及沉默胃癌细胞株的结果显示,AGS OE细胞株中CNR1的表达量显著高于对照组细胞（P＜0.0001）,即过表达胃癌细胞株构建成功;MGC-803 CNR1 RNAi细胞株中CNR1的表达量显著低于对照组细胞（P＜0.01）,即沉默胃癌细胞株构建成功。4.CCK-8结果显示,CNR1过表达细胞株在96小时的OD450值显著低于对照组细胞的OD450值（P＜0.01）。相反,CNR1沉默细胞株（MGC-803 CNR1 RNAi）的OD450值与对照组细胞株在96小时的OD450值相比显著升高（P＜0.001）。5.Ed U结果显示,CNR1过表达细胞株（AGS CNR1 OE）的细胞增殖数与对照组相比,显著降低;CNR1沉默后胃癌细胞株（MGC-803 CNR1 RNAi）的增殖数与对照组相比显著增加。6.细胞划痕实验结果显示,细胞内CNR1过表达后（AGS CNR1 OE）48 h的划痕宽度显著大于对照组,P＜0.05;CNR1沉默细胞株MGC-803 CNR1 RNAi细胞48 h的划痕宽度显著小于对照组,P＜0.01。7.Transwell结果显示,CNR1过表达组（AGS CNR1 OE）的跨膜细胞数显著少于对照组,P＜0.001;CNR1沉默细胞（MGC-803 CNR1 RNAi）跨膜细胞数与对照组相比显著增多,P＜0.05。8.当BGC-803 CNRIP1 OE细胞系中CNR1过表达后,细胞48h的划痕宽度较BGC-803 CNRIP1 OE及BGC-803均显著增加,P＜0.01,而当BGC-803 CNRIP1OE细胞中CNR1沉默后,细胞划痕宽度较BGC-803 CNRIP1 OE及BGC-803CNRIP1＆CNR1 OE均显著降低,P＜0.001。9.当BGC-803 CNRIP1 OE细胞株中CNR1过表达后,细胞在96小时的OD450值显著低于BGC-803 CNRIP1 OE的OD450值,P＜0.05;与之相反,当BGC-803 CNRIP1 OE细胞株中CNR1沉默后,细胞在96小时的OD450值与BGC-803CNRIP1 OE相比显著增加,P＜0.001。10.当BGC-803 CNRIP1 OE细胞系中CNR1过表达后,跨膜细胞数较CNRIP1 OE及对照细胞相比显著降低,P＜0.05;当BGC-803 CNRIP1 OE细胞株中CNR1沉默后,跨膜细胞数与BGC-803 CNRIP1 OE及BGC-803CNRIP1＆CNR1 OE相比显著增加,P＜0.001。11.BGC-803 CNRIP 1 OE＆CNR1 RNAi组细胞形成的肿瘤体积大小与其余三组细胞相比显著增大。当细胞中CNRIP 1过表达后所形成的肿瘤体积大小显著小于正常对照组。BGC-803 CNRIP 1 OE＆CNR1 OE细胞株形成的肿瘤体积大小显著小于其余三组。小结CNR1的表达水平不受CNRIP1的影响;CNR1抑制细胞的增殖、迁移和侵袭;CNRIP1对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用需要CNR1介导实现。第四部分CNRIP1-CNR1复合体通过激活内在大麻素受体系统抑制肿瘤细胞活动目的本部分研究通过构建CNR1突变体细胞,并通过免疫共沉淀实验验证其二者互作,通过PKA激酶检测验证CNRIP1-CNR1复合体对PKA激酶的激活情况,利用Western blot检测CNR1下游信号通路及凋亡相关蛋白的表达情况以探究CNRIP1-CNR1复合体与内在大麻素受体系统抑制肿瘤细胞活动的作用机制。方法1.通过CRISPR-Cas9技术构建CNRIP1野生型过表达（WT OE）及CNRIP1突变型过表达（MT OE）胃癌细胞系,并通过Western blot技术检测CRISPR的表达水平以验证细胞系构建成功。2.通过Co-IP实验验证胃癌细胞内CNRIP1与CNR1的蛋白互作。3.通过CCK-8检测法,对CNRIP1 WT OE及CNRIP1 MT OE胃癌细胞系的细胞活力进行检测。4.通过流式细胞术,检测CNRIP1 WT OE及CNRIP1 MT OE胃癌细胞系的细胞凋亡情况。5.通过PKA激酶活性检测,对CNRIP1 WT OE及CNRIP1 MT OE胃癌细胞系中PKA的激活情况进行检测。6.通过Western blot实验检测CNRIP1 WT OE及CNRIP1 MT OE胃癌细胞系内源大麻素信号通路及凋亡相关蛋白的表达。结果1.Western Blot实验结果表明,CNRIP1-MT OE及CNRIP1 WT OE细胞中CNRIP1的蛋白表达与对照组相比显著上调,即CNRIP1-MT OE和CNRIP1 WT OE细胞株构建成功。2.CO-IP实验结果表明,野生型CNRIP1过表达细胞中的CNRIP1可与CNR1相互作用形成蛋白复合体,而当CNRIP1序列被突变后,CNR1蛋白无法被共沉淀。3.CCK-8细胞活力检测结果显示,CNRIP1 MT OE组细胞在72小时的OD450值显著高于CNRIP1 WT OE组细胞的OD450值,P＜0.05。4.流式细胞凋亡实验结果表明,CNRIP1 WT OE组凋亡细胞数显著多于CNRIP1 MT OE与对照组细胞,且当采用内源大麻素AEA处理细胞后,CNRIP1WT OE组凋亡细胞数进一步增加,而CNRIP1 MT OE组细胞无显著变化。5.PKA激酶活性检测结果表明,CNRIP1 WT OE细胞株PKA活性显著高于CNRIP1 MT OE与对照组细胞。6.Western blot结果表明,CNRIP1 WT OE组细胞与对照组及CNRIP1 MT OE组细胞相比,p ERK1/2的表达显著上升,即同时,细胞内凋亡相关蛋白Bcl2及e Caspase3的表达显著上调,与之相反,胞内Bax蛋白表达显著下调。小结CNRIP1-CNR1复合体通过激活内在大麻素受体系统抑制肿瘤细胞活动。结论1.生物信息学分析显示CNRIP1启动子甲基化及表达水平与胃癌的发生有关。2.CNRIP1作为胃癌的抑癌基因抑制胃癌细胞的增殖、转移和侵袭。3.CNR1抑制胃癌细胞的增殖、转移、侵袭;且CNRIP1通过CNR1实现生物学功能。4.CNRIP1-CNR1复合物通过调节PKA激酶活性,激活内源性大麻素系统促进胃癌细胞凋亡。