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急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病。AML是成人最常见的急性白血病,也是儿童第二常见的急性白血病。急性髓系白血病是一种以异质性生物学为特征的疾病,导致不同的临床结果,包括复发。由于患者的原因（年龄和并存疾病）和内在生物因素使得急性髓细胞白血病治疗仍具有挑战性。尽管通过使用一些靶向药物如米多妥林和依那西尼布使患者的生存率有了提高,但是复发率仍然很高,并且仍有大量患者死于急性髓细胞白血病。目前,耐药是AML化疗的主要障碍。大多数急性髓系白血病患者对初始化疗有反应后仍对化疗药物产生多药耐药（MDR）。并且该疾病的复发对患者生存有不良影响。因此,医学上非常需要研究MDR可能涉及的分子机制,以改善AML患者的预后。研究表明长链非编码RNAs（Long noncoding RNAs,LncRNAs）在生理和病理的发展中发挥着重要作用。近几年来,非编码RNA参与各种肿瘤多药耐药的机制已被证实。长链非编码RNAs的失调已被报道参与多种功能许多癌症的细胞过程包括细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移和转移。越来越多的证据表明长链非编码RNAs与耐药或药物敏感性有关,并且大量的研究也重点聚焦于揭示LncRNAs调控的耐药的确切分子机制。许多LncRNAs已被报道参与肿瘤细胞的化疗耐药,包括肝细胞癌细胞、人肺腺癌细胞和AML细胞。结直肠癌差异表达基因（Colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE）是一种 LncRNA,其位于第16染色体上,并位于IRX5基因对面,其首次被证实结直肠腺瘤中表达水平升高。上调的CRNDE已被证实为AML的生物标志物并促进了 AML细胞的恶性进展,但是CRNDE在AML疾病MDR中的具体作用和机制尚不清楚。在本研究中,探讨了 CRNDE在外周血单核细胞（PBMCs）中的表达。并分析了急性髓细胞白血病患者及以阿霉素（ADR）为基础的化疗后患者中CRNDE的表达关系;检测了患者细胞中多药耐药相关蛋白的表达。进一步,构建耐药细胞株（Kasumi-1/ADR）,进行细胞体外功能及分子机制研究实验,包括研究CRNDE敲低对细胞增殖、凋亡、细胞周期及功能相关蛋白的影响;CRNDE敲低对细胞中耐药相关蛋白及其对ADR药物敏感性的影响;并分析和验证其涉及的信号通路机制。最后,通过动物实验验证CRNDE敲低后对体内AML细胞生长及其药物敏感性的影响及可能的机制。本研究旨在探讨CRNDE在AML的MDR中的作用及其潜在的分子机制。本研究的结果可能有助于为AML患者逆转多药耐药提供一种新的治疗策略。本课题包括以下三部分:1.LncRNA CRNDE在化疗前后AML患者PBMC中的表达及化疗耐药相关性研究;2.敲低LncRNA CRNDE表达对AML细胞生物功能和耐药性的影响及机制研究;3.敲低LncRNA CRNDE表达对动物体内AML细胞生长及其药物敏感性的影响及可能的机制研究。第一部分:LncRNA CRNDE在化疗前后AML患者中的表达及化疗耐药相关性研究方法1.qRT-PCR检测AML患者（化疗前19例和化疗后19例）和健康志者PBMC 中 CRNDE 和 MDR1 表达。2.Western blot检测PBMC中P-gp表达水平。3.凝胶电泳半定量5个AML患者和健康志愿者样本PBMC中CRNDE表达。4.SPSS软件统计分析化疗前和化疗后AML患者PBMC中CRNDE及P-gp表达。5.SPSS软件统计分析化疗后MDR1和CRNDE表达水平的关系。结果1.qRT-PCR结果表明,与健康对照组相比,AML患者PBMC中CRNDE显著升高。2.核酸凝胶电泳半定量分析显示,与健康对照组相比,在随机选取的5例AML患者PBMC中CRNDE表达也显著升高。并且P-gp表达也显著升高。3.qRT-PCR及Western blot显示,化疗后AML患者PBMC细胞中的CRNDE和P-gp水平显著升高。4.SPSS软件统计分析表明耐药相关基因MDR1表达水平与CRNDE水平呈显著正相关的关系。第二部分:敲低LncRNA CRNDE表达对AML细胞生物功能和耐药性的影响及机制研究方法1.本实验室使用ADR剂量递增的诱导方法获得Kasumi-1/ADR细胞株。2.qRT-PCR 检测 HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR 和人骨髓基质细胞HS-5中CRNDE表达。3.qRT-PCR 和 Western blot 法检测 HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR细胞中MDR1/P-gp的表达。4.慢病毒介导的基因表达敲低HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR细胞中CRNDE的表达,qRT-PCR检测CRNDE基因敲低的效率。5.MTT和EDU检测各组细胞的增殖情况,Western blot检测各组细胞中ki67表达检测。6.流式细胞术检测各细胞凋亡和周期分布,Western blot检测凋亡蛋白和周期相关蛋白的水平。7.qRT-PCR和Western blot检测CRNDE敲低后耐药细胞株HL60/ADR和 Kasumi-1/ADR 中 MDR1/P-gp 水平。8.MTT 检测 CRNDE 敲低对 HL60/ADR 和 Kasumi-1/ADR 细胞对 ADR 药物敏感性的影响,并分析IC50。9.Western blot 检测敲低后 HL60/ADR 和 Kasumi-1/ADR 细胞中 Wnt 信号通路蛋白分子水平。10.Wnt5a过表达在CRNDE敲低的耐药细胞中进行逆转实验,qRT-PCR检测Wnt5a过表达的效率,MTT和Western blot实验验证CRNDE敲低对HL60/ADR和Kasumi-1/ADR细胞耐药及Wnt信号通路的影响。结果1.qRT-PCR结果分析表明,与HS-5细胞相比,HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR细胞中CRNDE表达均明显升高,且耐药细胞株Kasumi-1/ADR,HL60/ADR 中 MDR1 的水平升高。2.慢病毒介导的基因干扰方法显著敲低HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR细胞中CRNDE的表达。3.MTT和EDU实验结果均显示CRNDE敲低抑制HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR细胞增殖能力,且western blot实验结果显示增殖标记蛋白Ki67表达水平,与细胞的增殖能力结果一致。4.流式细胞术结果发现,CRNDE敲低增加HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR的凋亡率,并抑制细胞周期的正常进程。凋亡和周期相关蛋白水平结果进一步表明CRNDE敲低增加HL60、Kasumi-1、Kasumi-1/ADR、HL60/ADR的凋亡,并抑制细胞周期的正常进程。5.qRT-PCR和Western blot分析结果发现CRNDE敲低降低耐药细胞HL60/ADR 和 Kasumi-1/ADR 中 MDR1/P-gp 水平。6.MTT结果显示,CRNDE敲低促进HL60/ADR和Kasumi-1/ADR细胞的药物敏感性,显著降低细胞ADR的IC50值。7.Wnt信号通路蛋白分子水平结果显示,CRNDE敲低后HL60/ADR和Kasumi-1/ADR 细胞内 β-catenin 及其下游靶基因（c-Myc 和 cyclinD1）在Wnt/β-catenin通路中的表达均明显被抑制。8.Wnt5a过表达后逆转CRNDE敲低对HL60/ADR和Kasumi-1/ADR细胞内P-gp水平的抑制作用,促进该信号通路的激活。9.Wnt5a过表达逆转CRNDE敲低对HL60/ADR和Kasumi-1/ADR细胞药物敏感性的增强,降低细胞药物敏感性。第三部分:敲低LncRNA CRNDE表达对动物体内AML细胞生长及其药物敏感性的影响及可能的机制研究方法1.小鼠分为三组,皮下注射 sh-Ctrl-HL60/ADR 和 sh-CRNDE-HL60/ADR细胞,获得AML移植瘤模型。定期对小鼠进行ADR（实验组）或生理盐水处理（对照组）。2.CRNDE敲低后移植瘤的生长及小鼠的存活率观察和记录。3.Western blot检测Wnt信号通路和耐药相关蛋白。结果1.与生理盐水处理（对照组）和ADR+sh-Ctrl-HL60/ADR细胞相比,ADR和CRNDE敲低处理后显著抑制移植瘤的生长,并增加小鼠的存活率。2.与生理盐水处理（对照组）和ADR+sh-Ctr-HL60/ADR细胞相比,ADR和CRNDE敲低处理后,移植瘤组织中Wnt信号通路被抑制,且耐药相关蛋白P-gp水平被显著抑制。结论1.与健康对照组相比,AML患者PBMC细胞中CRNDE显著升高。此外,化疗后AML患者PBMC细胞中的CRNDE水平显著升高。并且耐药相关基因MDR1表达水平与CRNDE水平呈显著正相关的关系。表明CRNDE可能与AML多药耐药的产生和发展有关。2.CRNDE敲低抑制AML细胞增殖,周期进程,促进细胞凋亡。CRNDE敲低抑制耐药AML细胞中MDR1/P-gp表达水平,且增加耐药细胞的药物敏感性。CRNDE敲低通过抑制Wnt信号通路抑制P-gp表达进而增强AML细胞的药物敏感性。3.体内移植瘤实验表明ADR和CRNDE敲低处理抑制小鼠AML移植瘤的生长并提高小鼠的生存率。ADR和CRNDE敲低处理抑制移植瘤组织中Wnt信号通路和P-gp水平。推测,CRNDE敲低可以一定程度逆转AML的耐药。