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微藻被认为是蛋白质、碳水化合物、脂类和食品、医药、化妆品和能源产品色素等多种成分的新型绿色来源。蛋白核小球藻作为一种单细胞藻类,具有丰富的营养价值和药用价值。国内外对蛋白核小球藻的生物活性成分研究如多糖、多肽、糖蛋白等进行了广泛研究,本文对蛋白核活性蛋白及多肽的抗氧化及脂质代谢调节和机理进行研究,为了进一步扩展了蛋白核小球藻的食用和药用价值。利用浸泡、反复冻融、超声破碎和均质联合破碎对蛋白核小球藻细胞进行破壁处理,蛋白得率为72.4%,提取率为47.15%。将得到的蛋白进行脱色处理,对比脱色对其氧化活性影响,结果显示未脱色的蛋白具有较强的清除自由基的能力。将未脱色蛋白用四种常见酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)分别在各自最适条件下进行酶解处理,并测定其水解度以及分子量分布情况,结果表明胃蛋白酶酶解得到的多肽水解度最低,且对应的多肽分子量<1000 Da仅占9.03%,碱性蛋白酶酶解后得到的多肽水解度最高,<1000Da的分子量高达14.06%。各酶解多肽的抗氧化活性的结果显示木瓜蛋白酶酶解多肽对ABST自由基的清除能力最高,在浓度为1000μg/mL时,其清除率为95.76%,与阳性对照Vc在10μg/mL的清除能力相当。各组份抑制脂肪酶活力为依据,通过铜皂法测定提取蛋白及各酶解多肽对胰脂肪酶(PL)活性抑制能力,各组对PL活性抑制能力顺序为:碱性蛋白酶酶解多肽>胃蛋白酶酶解多肽>胰蛋白酶酶解多肽>木瓜蛋白酶酶解多肽>提取蛋白。其次,在对3T3-L1前脂肪细胞脂分化模型和LO2肝细胞脂变性模型研究中,测定各组分对甘油三酯和脂质的清除能力,结果发现在同一浓度下胰蛋白酶酶解多肽和碱性蛋白酶酶解多肽在对3T3-L1成脂细胞甘油三脂(TG)的清除率分别为26.47%和24.29%,而木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶在对LO2的细胞脂质清除能力较高。综合考量各酶解多肽活性,选择碱性蛋白酶为研究对象,进行超滤处理后发现分子量<5k Da(Ae)具有较强的脂肪酶活性抑制能力,其抑制率高达75.73%。Ae组分经过葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25分离后得到四个组分(AI、AII、AIII和AIV),用铜皂法对比分离的各组分对PL的抑制活性,选择活成成分较好的A-II经LC-MS/MS质谱分析后通过MASCOT对比分析搜库解谱,得到6条多肽分别为SISISVAGGGR、LLVVYPWTQR、SDDPHTFGQGTK、SRQLTLYPGAER、KNGAPAEK和KQTALVELVK。通过Peptide Ranker(http://bioware.ucd.ie)和Pep-site(http://pepsite2.russelllab.org/)筛选出LLVVYPWTQR(PP1)(MW 1274.53 Da)进行研究。结果显示PP1(200μg/mL)对PL的活性抑制率47.95%,分子对接的结果,分析其与PL活性位点之间的氢键、静电和疏水相互作用。构象揭示了PP1与PL的催化位点(Ser153,Asp177 and His 264)主要以氢键为主。然而其在浓度为600μg/mL时,对前脂肪细胞3T3-L1细胞内甘油三酯的清除率高达为27.9%,通过激活能量代谢通路AMPK,抑制SREBP-1c(固醇调节元件结合蛋白-1 C)信号蛋白及与脂肪细胞分化相关的C/EBP-α蛋白表达,实现其调节脂质代谢能力。在进一步深入的动物层面上的研究表明,相对于肥胖模型组,Ae能将小鼠体重降低了22.98%略低于阳性对照奥利司他(33.17%),同时能够有效的减轻脂肪肝的症状,减少脂质的聚集,催化TG和TC分解,降低血液中血脂水平;可以通过抑制相关的C/EBP-α蛋白表达阻止脂质的合成,此外结果发现Ae能够激活NF-κB通路缓解肝肪脏引起的炎症,改善小鼠的炎症状态;肠道菌群层面上,Ae显著增加厚壁菌与拟杆菌比例至2.04、丰富肠道菌群属,Ae调节COG类主要参与代谢,包括氨基酸的生物合成、氨基酰基传递的生物合成以及次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢。KEGG信号通路分析也证实Ae与脂质代谢、碳代谢密切相关。这些发现可能为了解Ae在NAFLD发展和进展中的作用提供制度上的启示。模拟人体消化,将蛋白核小球藻蛋白经胃蛋白酶及胰蛋白酶在人体温度为37℃下酶解得到后,超滤<5k Da以下的分子为TPe。TPe组分经过葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25分离后得到四个组分(TP-I、TP-II、TP-III和TP-IV),用铜皂法对比分离的各组分对PL的抑制活性,选择活成成分较好的TP-IV经LC-MS/MS质谱分析后通过MASCOT对比分析搜库解谱,得到4条多肽分别为VVPEGVR、GSGFCGSSR、NPDGEPR和RDAEEWFHAK。通过Peptide Ranker(http://bioware.ucd.ie)和Pep-site(http://pepsite2.russelllab.org/)筛选出RDAEEWFHAK(TP1)进行研究。结果显示TP1(200μg/mL)对PL的活性抑制率40.2%,然而其在浓度为600μg/mL时,对前脂肪细胞3T3-L1细胞内甘油三酯的清除率高达为23.59%,分子对接的结果,TP1与PL的对接分数仅为136.7且仅有3个氢键与PL活性位点相连接。在对TPe体内活性研究中发现,TPe减缓高脂饲料喂养小鼠体重增长,减少肝脏脂质的堆积,催化TG和TC分解,降低血液中血脂水平;同时可以通过激活SIRTI/FOXP3神经信号通路实现。