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革兰氏阴性细菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)是一个由多组分蛋白复合体形成的跨膜通道,将蛋白分泌到胞外环境中或把毒力蛋白直接注入宿主细胞,从而刺激宿主细胞的信号转导途径,导致一系列的细胞效应,如肌动蛋白的变构导致细胞骨架的重排、转录因子的激活、离子通道的刺激、在某些细胞会出现细胞凋亡等。磷脂酰胆碱(PC)是真核生物膜磷脂中的主要组分。细菌基因组数据库推测,超过总数15%的细菌中可能含有PC,且绝大多数含PC的细菌都是与真核生物相关联的致病菌或共生菌。细菌PC的合成主要由N-甲基化途径和/或磷脂酰胆碱合酶(PCS)途径来完成。离体研究发现膜磷脂成分对膜蛋白的转位效率、拓扑结构、稳定性、组装成复合体分泌过程中的转运和分拣以及酶的活性都有十分重要的影响。2010年我们通过对磷脂酰胆碱合酶基因(PCS)在细菌致病性中的作用开展研究,经过两年多的努力,成功构建了Pseudomonas sp.593和P. syringae pv. syringae van Hall1336两种模式细菌的PCS突变体,发现PC缺失导致丁香假单胞菌丁香致病变种丧失了致病能力,而该致病能力的丧失与Ⅲ型分泌系统的功能密切相关。所以在确立了PC调控Ⅲ型分泌系统的功能后,为了进一步探讨PC影响T3SS分泌系统作用的分子机制,拟通过从转录水平、翻译水平、转运水平比较T3SS分泌系统机器相关蛋白在Pseudomonassp.593和P. syringae pv. syringae van Hall1336野生型和突变型中的差异,探明其分子机理。因此本研究试图克隆、表达P. syringae pv. syringae van Hall1336中T3SS全部相关蛋白基因并进行蛋白纯化、注射新西兰大白兔制备多克隆抗体,目前取得的成果为：1.根据已报道的P. syringae pv. Syringae B728a菌株的基因组信息,从NCBI数据库中查出中Ⅲ型分泌系统含有27个基因。因此推测模式菌株P. syringae pv. syringae van Hall1336的Ⅲ型分泌系统由27个主要蛋白基因构成。除了前期实验室克隆的3个基因之外,本研究从P. syringae pv. syringae van Hall1336基因组中克隆出22个基因。并对克隆的22个基因进行了生物信息学分析。2.将克隆的22个基因分别与表达载体pET23a或pGEX-6p-1连接形成重组质粒,并转化E. coli BL21(DE3)plysS或E. coli Transta细胞,进行蛋白表达和纯化。成功表达了16个蛋白,成功纯化了10个。3.通过注射新西兰大白兔,成功制备了6个多克隆抗体。为后续进行Western blotting分析比较野生型和PCS’突变型细菌胞质蛋白、膜蛋白、胞外蛋白的差异,推断PC是否通过影响Ⅲ型分泌机器组件蛋白的转运组装而调节该分泌系统的功能。