研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是血管最丰富的恶性肿瘤之一。尽管索拉菲尼等靶向血管生成的药物取得了一定的治疗效果,但仍然有50-86%的肝细胞癌细胞存活并导致患者预后不良。目前认为,血管生成抑制加剧的肿瘤局部缺氧是促进HCC恶性增殖、复发和耐药的重要原因。研究发现,缺氧能够导致HCC发生能量代谢重构,即由依赖氧化磷酸化转变为依赖无氧糖酵解。无氧糖酵解能够为磷酸戊糖途径及己糖胺、氨基酸等生物合成过程提供重要原料,在细胞存活、凋亡逃逸等方面发挥关键作用。线粒体作为细胞中最主要的耗氧场所和能量代谢中枢成为研究热点。目前认为,缺氧能够通过诱导线粒体自噬选择性清除受损或功能障碍的线粒体。线粒体自噬一方面能够抑制线粒体氧化磷酸化,另一方面可以减轻ROS积累诱导的促凋亡信号的活化,在缺氧介导的能量代谢重构中扮演重要角色。因此进一步研究线粒体自噬在缺氧导致的HCC细胞能量代谢重构中的作用,可能为增强索拉菲尼等靶向血管生成药物的疗效提供新的线索。组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6,HDAC6）是重要的自噬受体,不仅参与自噬体的形成和运动,作为IIb类组蛋白去乙酰化酶,还可以通过去乙酰化组蛋白及其非组蛋白底物如HSP90、β-catenin参与调控肿瘤细胞的增殖、自噬、侵袭、转移和有丝分裂等过程。β-catenin是经典Wnt/β-catenin信号通路的核心转录因子。在细胞核中,β-catenin通过募集共激活因子和转录因子,影响细胞增殖、糖代谢和细胞周期调节相关靶基因的转录。β-catenin的蛋白稳定性、转录活性和亚细胞定位受翻译后修饰的调控,不同位点的乙酰化修饰可能会影响β-catenin对不同辅因子的亲和力。以上提示,从HDAC6/β-catenin信号入手可能是阐明缺氧介导的线粒体自噬促进HCC细胞能量代谢重构的突破口。研究目的:本项目通过研究缺氧介导的线粒体自噬通过HDAC 6/β-catenin信号轴诱导肝细胞癌细胞能量代谢从氧化磷酸化向糖酵解转化的机制,为靶向细胞能量代谢治疗肝癌提供理论依据。研究方法:1.MTT法检测缺氧对SNU387细胞、SNU449细胞活力的影响2.使用葡萄糖、乳酸试剂盒检测缺氧处理后SNU387细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量的变化。OCR探针检测缺氧对SNU387细胞耗氧率的影响。3.流式细胞术检测缺氧处理后SNU387细胞线粒体数量的变化。分离细胞线粒体后,Western blot实验检测缺氧处理后自噬相关蛋白的蛋白水平变化。4.免疫荧光实验检测缺氧对SNU387细胞中HDAC6亚细胞定位的影响。5.ELISA检测缺氧处理后HDAC6酶活性的变化。Western blot实验检测缺氧处理后HDAC6和ac-α-tubulin（乙酰化的α-tubulin）蛋白水平的变化。6.OCR探针检测缺氧处理后,HDAC6抑制剂对SNU387细胞耗氧率的影响。7.免疫荧光实验检测缺氧处理后,SNU387、SNU449细胞中β-catenin亚细胞定位的变化。8.qPCR检测缺氧处理后SNU387细胞中糖酵解关键酶HK2、PDK1以及LDHA转录水平的变化。9.MTT实验检测缺氧对SNU387、SNU449细胞索拉菲尼治疗敏感性的影响结果:1.MTT结果表明缺氧处理后SNU387、SNU449细胞活力增加。2.缺氧处理后,SNU387细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量均增加,细胞耗氧率降低。3.缺氧处理后,SNU387细胞线粒体数量减少,自噬相关蛋白P62、LC3在线粒体上积累增多。4.免疫荧光结果显示缺氧会促进SNU387中HDAC6的核周转移。5.缺氧处理后,SNU387细胞HDAC6蛋白水平和酶活性均增加,ac-α-tubulin蛋白水平下降。6.缺氧处理后,与对照组相比,HDAC6抑制剂组细胞耗氧率增加。7.免疫荧光实验结果表明,缺氧处理后,SNU387、SNU449细胞β-catenin核易位增加。8.QPCR结果表明缺氧会促进SNU387细胞糖酵解关键酶HK2、PDK1以及LDHA的转录。9.MTT结果表明缺氧处理后,SNU387、SNU449细胞对索拉菲尼的敏感性降低。结论:1.缺氧诱导的线粒体自噬可能增强了HCC细胞HDAC6的活性。2.HDAC6通过抑制β-catenin乙酰化水平参与了缺氧介导的肝细胞癌能量代谢重构机制。3.抑制缺氧诱导的HDAC6/β-catenin信号能够增强HCC细胞对于索拉菲尼的敏感性。