论文部分内容阅读
研究背景及目的重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种T细胞依赖、抗体介导的自身免疫性疾病，神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）处的乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor，AChR）为其主要自身抗原。实验性自身免疫性重症肌无力（experimentalautoimmune myasthenia gravis，EAMG）是研究MG发病机制和潜在治疗方法的可靠实用模型。虎杖(polygonum cuspidatum，PC)微苦、微寒，具有清热、解毒、利湿、活血功效，白藜芦醇（resveratrol，Res）是其有效成分之一，它们除具有抗氧化、抗肿瘤、调节脂代谢等作用外，还具有抗炎、免调节作用。另外虎杖还可以治疗蛇毒咬伤，其正丁醇提取物（n-butanol extract of PC，PCB）在体外能上调人类神经母细胞瘤细胞系（human neuroblastoma cell line，SH-SY5Y）烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic ace-tylcholine receptor，nAChR）的表达。关于中药对EAMG的研究较少且多以复方为主，单味苦寒类药物的研究更少，目前文献中尚未发现关于虎杖或其单体白藜芦醇对EAMG的研究。本实验目的是探讨虎杖及其单体白藜芦醇对EAMG是否有治疗作用及其可能的作用机制。材料与方法1.材料1.1实验动物：Lewis大鼠，雌性，140-160g，6-8周龄。1.2抗原：鼠源AChR-α亚基97-116肽(R97-116)。1.3药物：虎杖（中药颗粒），白藜芦醇。2.方法2.1EAMG模型的诱导和临床评分用R97-116免疫Lewis雌性大鼠建立EAMG模型，每天记录大鼠体重，并参照Lennon EAMG评分标准每天给予大鼠临床评分。2.2虎杖及白藜芦醇治疗EAMG随机将大鼠分为虎杖组（PC组）、白藜芦醇组（Res组）、对照组（C组），每组5只，于首次免疫后第5天开始每天分别给予PC（2g/kg）、Re（s20mg/kg）（溶于DMSO水溶液）相应治疗组大鼠灌胃，对照组给予等浓度DMSO（0.4ml/kg）溶液，直至EAMG大鼠发病高峰期第42天。2.3CCK-8检测淋巴细胞增殖取腹股沟淋巴结制备淋巴结单个核细胞（lymph node mononuclear cells，LMNC）悬液，进行CCK-8细胞增殖实验。2.4Elisa检测大鼠血清及淋巴细胞培养细胞上清细胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-4,IL-10, IL-17）2.5Elisa检测大鼠血清抗R97-116抗体（IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b）2.6免疫荧光检测大鼠腓肠肌NMJ突触后膜AChR2.7统计方法：本实验数据采用SPSS16.0统计软件分析，对3组样本进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较用LSD-t检验，对不满足方差齐性者采用Kruskal-Walli（sK-W）检验，P<0.05有统计学意义，结果以均数±标准差（Means±SD）表示。结果1.虎杖及白藜芦醇能缓解EAMG大鼠肌无力症状2.虎杖及白藜芦醇对EAMG大鼠CCK-8淋巴细胞增殖的影响在PBS、R97-116刺激条件下PC能抑制淋巴细胞增殖，Res对淋巴细胞增殖虽无统计学差异但有一定抑制趋势。3.虎杖及白藜芦醇对EAMG大鼠血清和淋巴细胞培养上清中细胞因子的影响虎杖及白藜芦醇下调血清及细胞培养上清中TNF-α，而对IL-10表现为上调，对IFN-γ、IL-4、IL-17无明显影响。4.虎杖及白藜芦醇对EAMG大鼠血清抗R97-116抗体的影响虎杖及白藜芦醇能降低血清中IgG1、IgG2a抗体水平，对IgG、IgG2b无明显影响。5.肌肉免疫荧光：治疗组AChR密集、结构相对完整，而对照组AChR结构不完整、局部缺如、相对凌乱，说明虎杖及白藜芦醇可能通过增加AChR表达和(或)减少其被破坏而保护EAMG大鼠NMJ-AChR。结论1.虎杖及其单体白藜芦醇能缓解EAMG症状，可能通过以下三方面机制发挥治疗作用：①通过抑制淋巴细胞增殖，下调TNF-α，上调IL-10，进而抑制EAMG大鼠血清R97-116抗体（IgG1, IgG2a）的产生；②虎杖及白藜芦醇代谢产物可能对R97-116抗体（IgG1, IgG2a）分子具有清除作用；③虎杖及白藜芦醇代谢产物可能增加神经肌肉接头AChR表达。2.单体白藜芦醇可能是虎杖缓解EAMG的主要有效成分，需进一步实验明确。