氮肥的施用是紫花苜蓿(Medicago sativa)高产优质的重要保障,氮肥利用率低下却对经济和生态产生了负效应,不利于农业的可持续发展。因此,通过生物学途径开发紫花苜蓿自身氮营养高效吸收利用的能力,是提高氮素利用效率的根本途径。本研究以全国范围内不同原产地、具有典型代表性的紫花苜蓿品种为材料,采用苗期初筛和全生育期及田间小区验证的方法,建立了紫花苜蓿氮效率评价系统,进一步在全生育期进行了不同氮效率类型的根系形态和生理特性、氮代谢关键酶活性、光合生理性状、结瘤固氮特性、输导组织解剖结构和基因表达特征的差异分析,并通过营养生长期和全生育期以氮营养阶段为主导划分了紫花苜蓿的生育期。主要研究结果如下:1建立紫花苜蓿氮效率评价系统从室内苗期筛选至室外全生育期验证,最后落实到田间小区生产,通过这一完整的主线建立了紫花苜蓿氮效率评价系统,通过变异特征和相关分析,确定地上部干重、单株干重、根长、根体积、地上部氮积累量和单株氮积累量为紫花苜蓿苗期氮效率的评价指标,用隶属函数法与聚类分析将其划分为4个氮效率类型,(1)双高效型,低氮和正常氮水平下均表现为高效型;(2)高氮高效型,正常氮水平下表现为高效型,低氮水平下表现为低效型;(3)低氮高效型,正常氮水平下表现为低效型,低氮水平下表现为高效型;(4)双低效型,低氮和正常氮水平下均表现为低效型。并最终确定紫花苜蓿6010为双高效型、甘农3号为高氮高效型、甘农7号为低氮高效型和陇东为双低效型种质。在各生育期双高效型植株的吸收和利用效率均高于双低效型品种,在每次刈割中双高效型品种的产量和品质也高于低效型品种。综合各项数据,双高效型在经济效益方面更具应用性。2明确不同氮效率紫花苜蓿氮代谢差异机理2.1低氮和正常氮水平下,不同氮效率类型均表现为苗期至现蕾期低氮水平下的总根长和根体积大于正常氮水平,现蕾期后则相反。不同氮效率类型的根系形态指标(根表面积、根平均直径)和根系生理指标(总吸收面积和活跃吸收面积)的差异无明显规律,但双高效型紫花苜蓿的总根长和根体积均大于双低效型品种,而且还具有较强的根系活力,说明双高效型品种具有较发达的根系,较高的氮吸收、累积和利用能力。由此可见,根系大小和活力是造成氮效率差异的根本原因。2.2不同氮效率类型的紫花苜蓿全生育期下根瘤数、根瘤重和单株固氮能力的变化趋势一致,均呈单峰曲线,结荚期达最大值;将氮浓度提高到适宜水平后,不同氮效率类型的紫花苜蓿均表现为其根瘤数和根瘤重增加,单株固氮能力加强;低氮水平下,双高效型和低氮高效型品种的根瘤固氮能力较强;正常氮水平下,双高效型和高氮高效型的根瘤固氮能力较强。2.3不同氮效率紫花苜蓿硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷草酰转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性存在明显的基因型差异,6种酶活性均随生育期的推进呈单峰曲线变化,在盛花期出现峰值,不同氮效率类型的GOGAT、GDH、GOT和GPT活性的差异无明显规律,低氮和正常氮水平下,双高效型品种的NR和GS活性均高于双低效型品种,低氮高效型和高氮高效型品种的NR和GS活性介于二者之间,且在2个氮水平下表现相反。这与氮营养类型代谢特点相一致,故NR和GS活性可作为评价的辅助指标。2.4不同氮效率类型的紫花苜蓿各生育期光合效应参数均存在差异,低氮和正常氮水平下,双高效型和双低效型品种比较,双高效型品种的光合效应指标表现相对较优。且与生物量表现出一致的变化。提高氮水平后,双高效型的净光合速率增加幅度最大,低氮高效型增加幅度最小,高氮高效型和双低效型品种的增加幅度介于中间,说明不同氮效率类型的光合作用对氮响应度不同,双高效型紫花苜蓿具有较强的光合能力。2.5正常氮水平下紫花苜蓿根、茎、叶中的维管束面积、木质部面积、韧皮部面积和导管数量均高于低氮水平;低氮水平下,双高效型和低氮高效型品种根、茎、叶的木质部面积、韧皮部面积和维管束面积较大,总导管数量较多;正常氮水平下,双高效型和高氮高效型的根、茎、叶的木质部面积、韧皮部面积和维管束面积较大,总导管数量较多;双高效型品种在2个氮水平下的输导组织结构相对来说发育较好,其木质部面积、韧皮部面积、维管束面积和总导管数均高于双低效型品种,低氮高效型和高氮高效型品种的各指标介于二者之间,且在2个氮水平下表现相反。3紫花苜蓿双高效型和双低效型氮代谢相关基因的表达特征在根系中,铵转运基因(AMT)和高亲和硝转运基因(NRT2)在双高效型品种6010中的表达量均高于双低效型品种陇东,且表达量随氮水平升高而升高;在地上部中,NRT2在双高效型品种6010中的表达量均高于双低效型品种陇东,AMT基因在双高效型和双低效型品种的表达量各有高低;紫花苜蓿双高效型品种6010与双低效型品种陇东相比,具有较强的吸收转运铵态氮和硝态氮的能力。4明确紫花苜蓿各生长时期的氮素来源4.1营养生长期间,低氮水平下,肥料氮所占比例逐渐减小,根瘤氮比例增加,生长至50d均以外源氮为主,60d时2个氮源持平,70d则以根瘤氮为主;正常氮水平下,虽然肥料氮所占比例逐渐减小,根瘤氮比例增加,但均以外源氮为主导,因此,在缺氮的情况下,以根瘤氮为主的时间比正常氮提前近30d;地上部是外源氮和根瘤固氮积累的主要部位,低氮处理下地上部所占比例为64.8%和53.6%,正常氮处理下所占比例为71.6%和72.4%。4.2将紫花苜蓿的生育期根据氮营养阶段可分为:苗期至现蕾期,主要依靠土壤氮和肥料氮,6010与陇东相比,6010的根瘤固氮作用较陇东大,吸收土壤氮的比例较陇东小。初花期至结荚期,主要依靠土壤氮和肥料氮,又有根瘤固氮的供应,2个品种吸收土壤氮的比例接近,肥料氮和根瘤固氮相差较大,陇东肥料氮为21.1%,6010仅为9.6%,但在营养阶段划分的大方向上是一致的。鼓粒期至成熟期,主要依靠根瘤固氮,土壤氮和肥料氮的作用已很小,其中根瘤固氮贡献为88.4%~89.6%,土壤氮为4.1%~10.0%,肥料氮为1.5%~6.4%。