【摘 要】
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研究背景及意义:结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）引发的人-兽共患传染病,巨噬细胞作为防御Mtb感染的主要宿主细胞,可以通过凋亡和自噬途径清除Mtb,限制其增殖;而Mtb也会通过一些机制诱导宿主细胞坏死以逃避免疫杀伤。研究表明,长链非编码RNA（L ongnon-coding RNA,LncRNAs）可在许多疾病
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（项目编号:32060160,32160162）； 宁夏自然科学基金重点项目（项目编号:2022AAC02009）；
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研究背景及意义:结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）引发的人-兽共患传染病,巨噬细胞作为防御Mtb感染的主要宿主细胞,可以通过凋亡和自噬途径清除Mtb,限制其增殖;而Mtb也会通过一些机制诱导宿主细胞坏死以逃避免疫杀伤。研究表明,长链非编码RNA（L ongnon-coding RNA,LncRNAs）可在许多疾病过程中参与坏死的调节。其中,LncRNA NR003508是本项目组前期研究发现的坏死相关的LncRNAs分子之一,有关其如何调控Mtb诱导巨噬细胞坏死的研究尚未见报道。因此,阐明LncRNA NR003508在Mtb感染巨噬细胞过程中对细胞坏死的调控作用具有重要的意义。目的与方法:本研究利用BCG（Bacillus Calmette-Guerin）感染巨噬细胞并通过小干扰RNA（siRNA）抑制细胞内LncRNA NR003508的表达,通过流式细胞术和Western Blotting等技术检测细胞坏死情况,探讨LncRNANR003508对BCG诱导小鼠巨噬细胞坏死的调控作用;通过生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因技术分析LncRNA NR003508调控BCG诱导巨噬细胞坏死的miRNA分子靶点;利用C57BL/6J小鼠建立干扰LncRNANR003508协同BCG感染模型,通过H＆E染色、免疫组化和免疫印迹等实验,从体内水平阐明LncRNANR003508对BCG感染诱导小鼠肺组织坏死的调控作用。实验结果如下:（1）BCG感染诱导细胞坏死,并且促进坏死相关因子RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表达,同时诱导LncRNANR003508在细胞核与细胞质中表达量升高。（2）BCG感染RAW264.7后,干扰LncRNANR003508可降低细胞坏死率,且细胞内ROS和Ca2+的含量均有所下调,进一步研究发现干扰LncRNA NR003508抑制了 RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表达。（3）BCG感染降低了细胞内miR-346-3p的含量,而干扰LncRNA NR003508显著上调了miR-346-3p的表达,进一步验证发现LncRNA NR003508通过海绵效应吸附miR-346-3p;过表达miR-346-3p抑制RIPK1的表达,并下调RIPK1的下游因子RIPK3和MLKL的表达,同时降低细胞内ROS和Ca2+的含量以及细胞的坏死率。（4）BCG感染C57BL/6J小鼠导致小鼠体重增长缓慢,引起肺组织病理损伤,并增加肺组织中坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL的表达,而对比BCG组,干扰LncRNANR003508与BCG共处理组的小鼠肺组织病理损伤显著减轻,且降低肺组织中坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL的表达。结论:BCG感染会诱导巨噬细胞坏死的发生,并促进LncRNANR003508在细胞中高表达。BCG感染细胞后,干扰LncRNANR003508可抑制其对miR-346-3p的海绵吸附作用,而过表达miR-346-3p会抑制靶基因RIPK1的表达,减弱RIPK1下游信号的激活,从而抑制细胞坏死的发生。
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