角膜缘部位是眼科研究中的热点之一,因为此处含有特殊的Vogt栅栏结构(Vogt Palisades),且角膜上皮的干细胞与其直接子代瞬间扩增细胞位于此结构中的上皮基底层,二者共同构成角膜缘祖细胞群(limbal progenitor cells)。该细胞群具有高度增殖和应激增殖能力,承担角膜上皮正常的补充和创伤后的修复功能,对于维持稳定的眼表环境至关重要。Vogt栅栏结构为其提供必要的龛环境,对维持其高增殖力和诱导定向分化起关键作用。随着年龄的增长,角膜缘组织环境和其中细胞受到内外环境的影响,作为一个外周干细胞池,其龛环境和祖细胞群在正常状态下、在人的一生中如何演变?由于既往观察手段的限制,这一问题未能得到解答。本研究第一部分通过活体角膜共焦显微镜(in vivo confocalmicroscopy,CM)观察四个年龄段正常人角膜缘微观结构,了解其Vogt栅栏存在比例、形态特点、及上皮基底细胞群的细胞形态和大小的年龄改变,借此探讨角膜缘龛环境、角膜缘祖细胞群的数量和增殖活力随年龄变化的规律。第二部分通过对不同年龄组的新鲜离体角膜缘组织行增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)免疫组织化学染色,评价角膜缘祖细胞群增殖力的年龄变化;并对新鲜离体角膜缘行透射电子显微镜检查,观察其上皮基底细胞超微结构的年龄改变,综合评价细胞分化程度和增殖活力的改变。　　 第一部分人角膜缘结构年龄变化规律的共焦显微镜研究　　 目的：应用CM研究人角膜缘干细胞龛环境和角膜缘祖细胞群活力和数量的年龄变化规律。　　 方法：选择正常人160例160只眼,按年龄进行分组,A组为0～19岁,B组为20～39岁、C组为40～59岁、D组为60～79岁,每组40例。使用CM观察其角膜缘,记录图象并计量角膜缘基底细胞大小,对各组Vogt栅栏存在情况和基底细胞大小进行统计分析,并对LSCs龛环境质量和祖细胞群增殖活力作出评价。　　 结果：(1)各年龄组Vogt栅栏存在比例为:A组为39只眼,占97.5％;B组为38只眼,占95.0％;C组为31只眼,占77.5％:D组为17只眼,占42.5％,经趋势x2检验有统计学意义(x2=38.734,p=0.000)。(2)Vogt栅栏结构形态特点:本研究中66.4％的清晰Vogt栅栏结构见于40岁以下人群,呈现较规则的上皮一基质交替条索或波浪状界面,基底层上皮细胞呈高亮反光且轮廓不清,状似上皮-基质交界线的明亮“镶边”,基质突起中央见小血管伴行。66.7％的Vogt栅栏结构不存在者为60岁以上人群,其角膜缘上皮层菲薄,上皮-基质交界面较平,基底细胞轮廓较清,胞体暗,核不明显,表浅基质中粗大血管清晰可见。C、D组受检者中的8例角膜缘结构介于以上两种表现之间,呈现萎缩的栅栏结构;上皮-基底交界面呈轻微的波浪形,明亮“镶边”明显减少甚至消失。(2)各年龄组基底细胞大小:A组为(9.89±1.12)μ m,B组为(10.65±1.45)μ m,C组为(10.70±1.39)μ m,D组为(12.22±1.42)μ m,经单因素方差分析差异有统计学意义(F=16.632,p=0.000),进一步LSC两两组间检验示除B、C组间差异无统计学意义(p=0.882)外,其余各两组间差异均有统计学意义(p值均小于0.05)。　　 结论：角膜缘干细胞龛环境随年龄改变有退化趋势;同时角膜缘祖细胞群数量减少,胞体增大,增殖活力降低。　　 第二部分人角膜缘祖细胞群增殖力和超微结构年龄变化规律的研究　　 目的：评价角膜缘祖细胞群增殖力和细胞分化程度的年龄变化。　　 方法：取自我院眼库新鲜离体人眼球60眼,同一供体仅纳入单眼。按供体年龄编入4组,每组15例:A组为0～19岁,B组为20～39岁,C组为40～59岁,D组为60～79岁。各年龄组10眼行PCNA免疫组织化学染色,对各样本角膜缘基底上皮细胞染色阳性率进行分级:阳性率0～25％为(+);25～50％为(++);50～75％为(+++);75～100％为(++++),比较各年龄组基底细胞染色分级结果及角膜缘上皮细胞整体染色情况。各年龄组5眼行角膜缘组织透射电子显微镜观察,比较各年龄组角膜缘基底上皮细胞超微结构特点,包括:细胞大小、形态、核质比、染色质形态、细胞骨架、细胞器、胞间连接结构等。　　 结果：(1)PCNA免疫组织化学染色:A组样本中,角膜缘基底上皮细胞核染色呈(++++)强阳性染色者占50％,其余三组则以(+)弱阳性染色为主,,分别占40％(4例)、60％(6例)、50％(5例)。此外,仅A组中可见3例样本浅表上皮细胞核染色和1例样本细胞质染色。(2)透射电子显微镜观察:A组的干细胞样细胞具有3个特点:胞体极小、细胞平行于基底膜方向伸展、细胞核内致密团块状异染色质多。而在其它年龄组中,干细胞样细胞与相邻基底细胞大小差异并不悬殊,细胞形态圆、椭圆或柱状,与其它基底细胞同样垂直于基底膜方向伸展,细胞核内常染色质为主,较为分散。　　 结论：随年龄增大,角膜缘组细胞群增殖力降低、分化程度增高,且该变化主要发生在青少年期,成年后基本维持稳定水平。