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开花是高等植物发育过程中最重要的阶段之一,是连接植物营养生长和生殖生长的桥梁。在拟南芥等模式植物中已经发现了五条调控开花的路径,并且发现了多个调控拟南芥开花的关键基因,比如LEAFY,SPLs,miR156,miR172,以及一些MADS-box基因比如APETAL1,SOC1,AGL24等。小桐子(Jatropha curcas)属于大戟科,为多年生木本植物,其种子油是加工生产生物燃油的优质原料。然而,小桐子开花习性不稳定,导致种子产量低,从而不能满足工业化生产的需要。对小桐子开花决定基因进行克隆和功能分析,明确其在小桐子开花调控网络中的功能,将有助于阐明小桐子的开花分子机理,为培育高产优质小桐子品种奠定基础。本研究的主要结果如下: 1.我们通过RACE的方法克隆了JcLFY全长cDNA,并通过在拟南芥和小桐子中超量表达JcLFY的方法分析JcLFY的功能。JcLFY与其它植物LFY相似性为66%-88%。JcLFY主要在小桐子花序芽、花芽和芯皮中表达,花芽发育早期的表达量最高;GA处理的结果显示JcLFY的表达量不受GA诱导。超量表达JcLFY的拟南芥出现极端早花现象,同时还伴随终端花和单花的出现。超量表达JcLFY能恢复拟南芥LFY功能丧失的突变体lfy-15晚花和多分枝的表型。基因芯片和实时荧光定量PCR检测结果显示超量表达JcLFY的拟南芥一些花分生组织决定基因和花器官发育基因的表达量都上升。超量表达JcLFY的小桐子出现轻微的早花现象,在JcLFY共抑制的植株中花序结构、花器官排列模式、数量以及果实形态等都发生明显的变化。在JcLFY共抑制植株的花芽中一些花分生组织决定基因和花器官发育相关基因的表达量都降低。以上结果说明JcLFY参与调控花分生组织起始、花器官数目和形态以及果实发育;转基因拟南芥的结果说明JcLFY是拟南芥LFY的同源基因,但是JcLFY对小桐子开花时间的影响却没有拟南芥明显。 2.为了研究调控小桐子开花基因,我们从小桐子中分离了AP1的同源基因JcA P1,JcAP1与其它植物AP1具有很高的相似性。JcAP1主要在小桐子的花序芽、花芽、花萼和花瓣中表达,花芽发育的早期表达量最高。使用35S组成型启动子超量表达JcA P1导致转基因拟南芥极度早花和产生不正常的花。并引起了转基因拟南芥AP1下游基因表达量的上升,另外超量表达JcAP1能够恢复ap1-11突变体的表型。说明JcAP1是拟南芥AP1的同源基因,二者具有相似的功能。用相同的启动子超量表达JcAP1的小桐子在亚热带地区能引起早花,然而开花只能在春季发生。说明JcAP1可能需要与其它因子共同作用才能调控小桐子开花。 3.通过分析小桐子花的EST文库我们找到一个在小桐子花芽中表达的MADS-box基因,命名为JcMADS1。JcMADS1与拟南芥AP1相似性为54.5%,与FUL相似性为50.6%。进化树分析结果显示JcMADS1与其它植物FUL聚类在同一进化枝上。JcMADS1主要在小桐子根,花序芽和花芽中表达,在花序芽发育早期表达量最高。用35S启动子驱动JcMADS1在拟南芥中超量表达后出现极端早花,并引起一些开花相关基因表达量的上升。但是超量表达JcMADS1不能恢复拟南芥ap1-11和ful突变体对应的表型。用相同的启动子在小桐子中超量表达JcMADS1也出现极端早花。此外,还引起转基因小桐子叶片形态改变以及在每个叶腋处都产生侧芽。转基因小桐子一些开花相关基因的表达量也上升,而分枝抑制基因JcCCD7、JcMAX1、JcBRC1、JcTB1等基因的表达量明显下降。这些结果说明JcMADS1是小桐子重要的开花决定基因和侧芽发育调控基因。 4.不同发育时期的JcmiR156、JcmiR172、JcSPL3、JcSPL9的表达谱显示:随着年龄的增长JcmiR172、JcSPL3、和JcSPL9的表达量逐渐上升;JcmiR156的表达量逐渐下降。用35启动子超量表达MIM156(靶标模拟)和JcmiR172的拟南芥都出现早花;然而用相同的启动子超量表达JcmiR156、rJcSPL3、rJcSPL9、以及MIM156均没有影响小桐子的开花时间。但是超量表达JcmiR172a的转基因小桐子童期明显缩短,转基因植株开花时间提前。超量表达JcmiR172a和rJcSPL9的小桐子在叶片、茎干、花、果实和种子等器官出现明显差异,超量表达rJcSPL9的小桐子种子产量明显增加。此外,我们还发现了JcmiR172通过间接调控术质素合成相关基因的表达调控木质部加厚。这些结果说明JcmiR156和JcmiR172是小桐子年龄的标志基因,在小桐子发育时期的转变过程中发挥重要作用,但是单独年龄并不决定小桐子开花。这部分研究有助于了解小桐子年龄相关基因的功能以及探索小桐子开花机理。