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1.目的本研究:⑴用不同浓度Omp31处理BV-2细胞6h(文献报道诱导自噬的时间),一是明确Omp31能否诱导BV-2细胞自噬,二是确定Omp31诱导自噬的合适浓度。⑵用合适浓度的Omp31处理BV-2细胞不同时间,目的是验证BV-2细胞发生自噬的时间是否和文献报道时间吻合,以便进一步研究自噬在BV-2细胞炎症中的机制。⑶用不同浓度的Rapa和3-MA处理BV-2细胞24h,以确定Rapa诱导自噬的浓度及3-MA抑制自噬的浓度。⑷用Omp31、Rapa及3-MA处理BV-2细胞,以确定自噬能否通过调控NF-κB(P65)通路影响TNF-α的表达。2.方法⑴羊布鲁杆菌Omp31诱导BV-2小胶质细胞自噬①(0、0.17、0.5、1.5、4.5、13.5)μg/m L Omp31处理BV-2细胞6h,用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3B的表达;RT-q PCR检测LC3B m RNA的相对表达水平;透射电镜观察BV-2细胞内的自噬体;ELISA法检测TNF-α、IL-6及IL-10的表达;②0.5μg/m L Omp31处理BV-2细胞(0、6、12、24)h,用Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的含量;RT-q PCR检测LC3B m RNA的相对表达水平;透射电镜观察BV-2细胞内的自噬体;ELISA法检测TNF-α、IL-6及IL-10的表达。⑵Omp31诱导的自噬对BV-2细胞NF-κB(P65)通路的作用①(2.5、5、10)μM Rapa、(2.5、5、10)m M 3-MA预处理BV-2细胞24h,用We stern blot检测自噬标志物LC3BⅡ蛋白的含量;②Omp31、Rapa及3-MA处理BV-2细胞6h,用Western blot检测自噬相关蛋白B eclin-1、LC3B、P62以及NF-κB(P65)通路相关蛋白IκBα、p-P65、t-P65的表达;ELIS A法检测TNF-α的表达;RT-q PCR检测(Beclin-1、LC3B、TNF-α)m RNA的相对表达;透射电镜观察细胞内自噬体;免疫荧光技术检测p-P65蛋白入核。3.结果⑴不同浓度Omp31处理BV-2细胞6h,发现0.5μg/m LOmp31能使LC3B蛋白及m RNA的表达量增加,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05),且能使LC3BⅡ蛋白含量增加(P<0.05),同时在透射电镜下可见较多自噬体;⑵各浓度组TNF-α、IL-6表达量均较对照组增加(P<0.05),0.5μg/m L实验组TNF-α、IL-6表达量较其他实验组低(P<0.01)。各实验组IL-10表达量较对照组均降低(P<0.05),且不具有浓度依赖性;⑶0.5μg/m LOmp31处理BV-2细胞不同时间,结果显示,各实验组LC3B蛋白的表达及LC3BⅡ蛋白含量较对照组增加(P<0.05),6h组LC3BⅡ蛋白含量及LC3Bm RNA表达量较其余各组增加(P<0.01),并且在透射电镜下可见较多自噬体;⑷各时间组TNF-α、IL-6表达量均较对照组增加(P<0.01),且具有时间依赖性,而IL-10表达量均较对照组减少(P<0.01),与时间无关;⑸5μM Rapa预处理BV-2细胞后LC3BⅡ蛋白含量较各组均增加(P<0.01),2.5m M3-MA预处理BV-2细胞能降低LC3BⅡ蛋白含量,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.01);⑹Omp31、Rapa和3-MA处理BV-2细胞,结果显示:Omp31和Rapa均能促进L C3B及Beclin-1蛋白表达,亦能促进二者m RNA的表达,且均能增加LC3BⅡ蛋白含量,以上结果与对照组结果相比差异均有统计学意义(P<0.05)。3-MA对LC3B蛋白和m RN A的表达以及Beclin-1蛋白的表达无影响,但较对照组能降低LC3BⅡ蛋白含量,并且抑制Beclin-1 m RNA的表达(P<0.05)。Omp31和Rapa都能降低P62蛋白含量,而3-M A则导致P62蛋白含量增加,与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。在透射电镜下可见Omp31和Rapa均能诱导自噬体形成,而3-MA对自噬体形成有抑制作用。⑺Omp31、Rapa及3-MA均能使IκBα和t-P65蛋白含量降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Omp31能增加p-P65蛋白水平,而Rapa和3-MA都能使p-P65蛋白水平降低,与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。用免疫荧光技术检测p-P65蛋白入核,可知Omp31能增加胞核内p-P65蛋白的含量,而Rapa及3-MA使胞核内p-P65蛋白含量减少;⑻Omp31与对照组相比能增加TNF-α表达量(P<0.01),而Rapa及3-MA则使TN F-α表达量降低(P<0.01)。与对照组相比,Omp31、Rapa和3-MA均能使TNF-αm RNA表达量降低(P<0.01)。4.结论⑴羊布鲁杆菌Omp31能诱导BV-2细胞自噬,并促进TNF-α、IL-6表达,抑制IL-10表达;⑵自噬能负性调控NF-κB(P65)信号通路,进而抑制TNF-α的表达。