研究背景白血病是全球儿童和青少年最常见的恶性肿瘤,其中急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）约占所有白血病病例的80%,是最常见的亚型。ALL的发病机制主要是淋巴细胞成熟过程中积累的各种遗传异常,以及控制细胞生长、增殖、存活和分化的机制的改变。由于恶性肿瘤细胞的谱系来源不同,ALL可分为两种类型:急性T淋巴细胞性白血病（T-ALL）和急性B淋巴细胞性白血病。在过去的50年里,由于在治疗方面的重大进步,ALL的5年生存率从10%增加到大约85%。然而,仍有相当数量的无反应和复发病例。进一步了解ALL复杂的生物学特性,是寻找新的治疗靶点和开发更有效的抗白血病药物的必要条件。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一种非蛋白质编码转录物,其长度为200余个核苷酸,不具有传统RNA一样编码蛋白质的功能。随着近年来对其认识的增加,发现多种恶性肿瘤的肿瘤发生和发展与lncRNA有关。以往的研究表明,lncRNAs作为抑癌基因或启动基因,在肿瘤的发生、转移或复发过程中起着至关重要的作用。此外,lncRNAs也已被证实影响ALL的肿瘤发生和进展。MAGI2反义RNA3（MAGI2-AS3）已被证明在不同类型的恶性肿瘤中下调并发挥致癌作用,如乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、膀胱癌等。值得注意的是,在ALL患者样本中发现了 MAGI2-AS3也出现显著下调。Chen等人最近的一项研究报道,MAGI2-AS3在急性髓系白血病中表现出较差的表达,这是白血病干细胞自我更新的原因。但是,MAGI2-AS3在ALL中的病理生理学功能尚待研究。微小RNA（microRNA,miRNAs）也是一种非编码RNA,相比于lncRNA长度更小,由18-24个核苷酸组成,但其能通过与3’-非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）结合,具有转录后调节靶基因的潜力。近年来的研究表明miRNA参与恶性肿瘤发生、发展的生物过程。MiR-452-5p已被证实为多种肿瘤中的肿瘤启动子。例如,miR-452-5p表达的增加通过调节PKN2/ERK/MAPK反馈环促进结直肠癌的发生。在肺鳞状细胞癌中,miR-452-5p上调与肿瘤淋巴结转移显著相关,并通过靶向CDKN1B在肿瘤进展中发挥重要作用。然而,在ALL的发生过程中,miR-452-5p是否参与尚未被研究。叉头盒N3（Forkheadbox N3,FOXN3）是叉头盒家族的成员之一,参与多种肿瘤的发生的病理生理过程。之前的文献证实,FOXN3在包括ALL在内的多种肿瘤中表达降低。更重要的是,生物信息学分析表明MAGI2-AS3和FOXN3在miR-452-5p中都有结合位点。因此,MAGI2-AS3可能通过miR-452-5p/FOXN3轴调节ALL的进程。为了验证上述假设,本研究探讨MAGI2-AS3在ALL中的调节功能和分子机制,为ALL的发病机制提供了新的见解。第一部分 MAG12-AS3在ALL中的表达目的探究MAGI2-AS3在ALL患者和ALL细胞株中的表达量以及干预MAGI2-AS3对ALL细胞株细胞活性的影响。方法1.利用生物信息学网站,检索MAGI2-AS3的基本信息。2.收集25例ALL患者和25例健康志愿者的骨髓组织样本,利用qRT-PCR检测MAGI2-AS3的表达量变化。3.qRT-PCR检测MAGI2-AS3在人ALL细胞株Jurkat,Reh,CEM,Molt4中的表达量变化与人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）进行对比。4.在Jurkat和Reh细胞中应用质粒过表达MAGI2-AS3,利用qRT-PCR检测MAGI2-AS3过表达的效率。5.转染MAGI2-AS3不同时间（0,24h,48h和72h）,利用CCK-8试剂盒检测MAGI2-AS3过表达组和vector组相比,对ALL细胞株细胞活性的影响。结果1.MAGI2-AS3（homo sapiens MAGI2 antisense RNA 3）位于人类基因组染色体7q21.11,是蛋白编码基因MAGI2的反义RNA,是由8个外显子组成的一种长链非编码RNA。2.与健康志愿者（0.91 ±0.09）相比,ALL骨髓组织标本中MAGI2-AS3的表达量（0.31±0.06）明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.与 PBMCs 相比,Jurkat,Reh,CEM 和 Molt4 细胞中 MAGI2-AS3 的表达量均出现下降,且差异具有统计学意义。其中,Jurkat和Reh细胞中MAGI2-AS3的表达量下降水平最为明显。4.MAGI2-AS3过表达能够明显降低Reh和Jurkat细胞的细胞活性。结论1.MAGI2-AS3在ALL患者骨髓组织样本和细胞系中的表达量下降。2.过表达MAGI2-AS3能够抑制ALL细胞株的细胞活性。第二部分 MAG12-AS3对ALL生物学行为的影响目的探究过表达MAGI2-AS3对ALL细胞株的细胞凋亡、细胞周期、浸润能力和糖酵解的影响,并在体内进一步验证。方法1.将Jurkat和Reh细胞分为两组:vector组和MAGI2-AS3组,采用流式细胞分析细胞凋亡能力变化,利用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达量变化。2.在Jurkat和Reh细胞中过表达MAGI2-AS3后,采用流式细胞分析细胞周期能力变化,利用Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK-4和CDK-6的表达量变化。3.将Jurkat和Reh细胞分为两组:vector组和MAGI2-AS3组,利用Transwell实验分析细胞浸润能力变化,利用Western blot检测细胞浸润相关蛋白E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 的表达量变化。4.将Jurkat和Reh细胞分为两组:vector组和MAGI2-AS3组,分析两组葡萄糖摄取、乳酸和ATP生成量,探究MAGI2-AS3过表达对ALL细胞株糖酵解的影响。5.利用vector和MAGI2-AS3转染Jurkat细胞,建立裸鼠异种移植肿瘤模型,分析MAGI2-AS3过表达对肿瘤体积和重量的影响,利用免疫组织化学技术探究肿瘤组织的凋亡,增殖和浸润变化情况。结果1.与vector组相比,MAGI2-AS3过表达能够促进Jurkat和Reh细胞的凋亡,该作用主要是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进促凋亡蛋白Bax的表达实现的。2.MAGI2-AS3组的Jurkat和Reh细胞细胞周期处于G0/G1期细胞增多,而处于S期的细胞减少,经检测,与vector组相比,MAGI2-AS3组CDK-4和CDK-6的表达量明显降低。3.与vector组相比,MAGI2-AS3过表达能够抑制Jurkat和Reh细胞的细胞浸润数量,并且MAGI2-AS3组的E-cadherin的蛋白表达量升高,而N-cadherin和Vimentin蛋白的表达量降低。4.与vector组相比,过表达MAGI2-AS3能够抑制Jurkat和Reh细胞对葡萄糖的摄取能力。并减少Jurkat和Reh细胞的乳酸生成量和ATP生成量。5.MAGI2-AS3过表达后,与vector组相比,肿瘤的体积增长速度明显减慢,在30天时,肿瘤的重量也相应减轻。通过免疫组织化学染色发现,MAGI2-AS3组的肿瘤组织中,细胞凋亡增加（TUNEL阳性细胞）,而细胞增殖（Ki67阳性细胞）和细胞浸润减少（Vimentin阳性细胞）。结论1.过表达MAGI2-AS3促进ALL细胞凋亡、细胞周期静止,抑制ALL细胞迁移和糖酵解。2.上调MAGI2-AS3抑制ALL肿瘤组织的生长。第三部分 MAG12-AS3对ALL的影响通过mi R-452-5p/FOXN3 轴实现目的探究MAGI2-AS3作用的下游信号分子,以及对ALL生物学行为产生影响的信号通路。方法1.在 Jurkat 和 Reh 细胞中,利用 qRT-PCR 检测 miR-452-5p 在 MAGI2-AS3过表达情况下表达量的变化情况。2.qRT-PCR检测miR-452-5p在ALL和健康志愿者骨髓组织中的表达量,并分析MAGI2-AS3与miR-452-5p之间的相关性。3.双荧光素酶报告基因检测分析MAGI2-AS3与miR-452-5p的结合关系。4.在 Jurkat 和 Reh 细胞中,利用 qRT-PCR 和 western blot 检测 FOXN3 在miR-452-5p过表达情况下mRNA和蛋白水平的变化。5.qRT-PCR检测FOXN3在ALL和健康志愿者骨髓组织中的表达量,并分析FOXN3与miR-452-5p之间的相关性。6.双荧光素酶报告基因检测分析FOXN3与miR-452-5p的结合关系。7.在 Jurkat 和 Reh 细胞中,利用 western blot 和 qRT-PCR 检测 vector 组,MAGI2-AS3 组,MAGI2-AS3+NC mimic 组和 MAGI2-AS3+miR-452-5p mimic组中FOXN3的蛋白和mRNA表达量变化。8.利用shFOXN3转染Jurkat和Reh细胞,通过CCK-8实验、流式细胞分析技术、Transwell实验、western blot、糖酵解检测分析在过表达MAGI2-AS3的同时,敲减FOXN3能否逆转过表达MAGI2-AS3对ALL细胞株细胞凋亡、周期、浸润和糖酵解的影响。结果1.在Jurkat和Reh细胞中,与vector组相比,miR-452-5p的表达量在MAGI2-AS3组中明显下降,与健康对照相比,ALL组中miR-452-5p的表达量升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）,Spearman相关性分析发现,MAGI2-AS3的表达量与miR-452-5p的表达量呈现负相关（r=-0.5743,P=0.0027）,2.双重荧光报告酶系统检测发现,与NC mimic相比,miR-452-5p mimic能够明显抑制Jurkat和Reh细胞中MAGI2-AS3-WT而不是MAGI2-AS3-MUT的荧光素酶活性。3.在Jurkat和Reh细胞中,与NC mimic组相比,FOXN3的mRNA和蛋白水平在miR-452-5p mimic的作用下均受到抑制,与健康对照相比,ALL组中FOXN3的表达量降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）,Spearman相关性分析发现,FOXN3与miR-452-5p的表达量呈现负相关（r=-0.4925,P=0.0124）),4.双重荧光报告酶系统检测发现,与NC mimic相比,miR-452-5pmimic能够明显抑制 Jurkat 和 Reh细胞 FOXN3-3’UTR-WT 而不是 FOXN3-3’UTR-MUT的荧光素酶活性。5.将 Jurkat 和 Reh 细胞各分为 4 组:vector 组,MAGI2-AS3 组,MAGI2-AS3+NC mimic 组和 MAGI2-AS3+miR-452-5p mimic 组,结果发现,与 vector组相比,过表达MAGI2-AS可以促进FOXN3的mRNA和蛋白表达量,而当同时用miR-452-5p mimic过表达miR-452-5p时,FOXN3的蛋白表达量与转染了MAGI2-AS+NC mimic组相比,FOXN3的表达水平受到抑制（P＜0.05）。6.将 Jurkat 和 Reh 细胞各分为 4 组:vector 组,MAGI2-AS3 组、MAGI2-AS3+shNC组和MAGI2-AS3+shFOXN3组,结果发现,敲减FOXN3逆转过表达MAGI2-AS3对ALL细胞株细胞活性、细胞凋亡、细胞周期、细胞浸润能力和糖酵解的影响。结论MAGI2-AS3通过miR-452-5p/FOXN3轴调控ALL细胞活性、细胞凋亡、细胞周期、细胞浸润能力和糖酵解等生物学行为。