论文部分内容阅读
正常的卵泡发育和排卵是一个复杂的动态生理过程,除受到促性腺激素的严格调控外,局部产生的生长因子和细胞因子也以自分泌或者旁分泌的方式在此过程中发挥重要调控作用。骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2,BMP2）作为转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族最大亚家族的重要成员,在卵巢颗粒细胞和黄体中显著高表达。既往研究表明,BMP2一方面通过促进颗粒细胞芳香化酶和FSH受体的表达以增加雌激素产生,另一方面通过抑制StAR和LH受体的表达减少孕激素的生成,进而发挥其对卵泡发育及排卵的调控作用。然而目前关于BMP2在排卵过程及排卵障碍性疾病中的调控功能研究仍有待拓展。鉴于此,本研究从以下三个方面探讨BMP2调控人颗粒细胞排卵相关基因表达的分子机制及其与排卵障碍性疾病多囊卵巢综合征（PCOS）发生发展的相关性,以期为临床应用中排卵异常的预防和治疗提供分子水平的理论依据:1.BMP2对人颗粒细胞纤溶酶原激活物抑制剂SERPINE2表达的调控作用及其机制2.BMP2对人颗粒细胞GREMLIN2表达的调控作用及其对GDF8相关信号通路的拮抗作用研究3.BMP2对人颗粒细胞IL-6表达的调控作用及其与PCOS发生的相关性第一部分BMP2对人颗粒细胞纤溶酶原激活物抑制剂SERPINE2表达的调控作用及其机制研究目的研究BMP2调控人颗粒细胞纤溶酶原激活物抑制剂SERPINE2表达的分子机制并验证SERPINE2在人颗粒细胞中的功能。方法按照梯度稀释的方法配置不同浓度（Ctrl、1、10和100 ng/mL）的BMP2,分别处理永生化的人颗粒细胞系（SVOG）和原代培养的人颗粒细胞（hGL）12小时和24小时,采用RT-PCR和Western Blot技术分别检测BMP2调控SERPINE2 mRNA和蛋白表达的浓度依赖性。然后用BMP2（50ng/mL）于不同的时间点（1、3、6、12和24小时）分别处理SVOG细胞,检测BMP2对SERPINE2表达的时间依赖性。TGF-β家族特异性受体抑制剂及小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术特异性敲低信号通路相关分子的内源性表达,探索BMP2调控SERPINE2表达的分子机制。收集SVOG细胞培养液,ELISA方法检测siSERPINE2后培养液中的uPA和tPA水平。应用PRISM软件采用各组间单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后多重比较（Tukey multiple-comparison tests）进行数据分析。结果BMP2上调SERPINE2表达具有显著的浓度（P＜0.0001）和时间依赖性（P＜0.0001）。应用TGF-β超家族特异性I型受体抑制剂dorsomorphin和DMH-1或siALK3可完全阻断BMP2对SERPINE2表达的促进作用。BMP2可激活经典的SMAD1/5/8信号通路和非经典的SMAD2/3及P38 MAPK信号通路,其中非经典的SMAD2/3及P38 MAPK信号通路参与BMP2对SERPINE2的表达调控。BMP2通过上调SERPINE2的表达抑制uPA和tPA的产生。结论BMP2通过激活非经典的SMAD2/3及P38 MAPK信号通路上调SERPINE2的表达,进而抑制颗粒细胞uPA和tPA的产生。第二部分BMP2对人颗粒细胞GREMLIN2表达的调控作用及其对GDF8相关信号通路的拮抗作用研究目的研究BMP2是否调控人颗粒细胞GREMLIN2（GREM2）的表达,验证GREM2对BMP2的拮抗作用并探索BMP2对GDF8相关信号通路拮抗作用的分子机制。方法按照梯度稀释的方法配置不同浓度（Ctr1、1、10和100 ng/mL）的BMP2,分别处理SVOG和hGL 12小时和24小时,采用RT-PCR和ELISA技术分别检测BMP2调控GREM2 mRNA和蛋白表达的浓度依赖性。然后用BMP2（50 ng/mL）于不同的时间点（1、3、6、12和24小时）分别处理SVOG细胞,探索BMP2对GREM2表达的时间依赖性。应用TGF-β超家族特异性受体抑制剂及siRNA技术特异性敲低相关信号通路分子的内源性表达,探索BMP2调控GREM2表达的分子机制。BMP2和GREM2同时处理SVOG和hGL细胞60 min,Western Blot 检测 P-SMAD2,P-SMAD3 及 P-SMAD1/5/8 的蛋白磷酸化水平,验证GREM2对BMP2信号通路的抑制作用。BMP2预处理SVOG和hGL细胞24小时后,GDF8继续处理SVOG细胞60 min,Western Blot检测P-SMAD 2及P-SMAD 3的蛋白表达,验证BMP2对GDF8相关信号通路的抑制作用。应用PRISM软件采用各组间单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后多重比较（Tukey multiple-comparison tests）进行数据分析。结果BMP2显著上调GREM2的表达且具有浓度（P=0.0005）和时间依赖性（P＜0.0001）。TGF-β超家族特异性I型受体抑制剂dorsomorphin和DMH-1或siALK2或siALK3可完全阻断BMP2对GREM2表达的促进作用。经典的SMAD1/5/8信号通路参与BMP2对GREM2的表达调控。GREM2可显著抑制BMP2诱导的SMAD1/5/8及SMAD2/3的磷酸化。GREM2也可显著抑制GDF8诱导的SMAD2及SMAD3的磷酸化。BMP2处理诱导的GREM2产生拮抗GDF8诱导的SMAD相关蛋白的磷酸化及PAI-1表达。结论BMP2通过上调GREM2的表达抑制GDF8诱导的相关信号通路及生物学功能。第三部分BMP2对人颗粒细胞白细胞介素6（IL-6）表达的调控机制及其与PCOS发生的相关性目的研究BMP2是否调控人颗粒细胞细胞白细胞介素6（IL-6）的表达及其机制,并探讨其与排卵障碍性疾病PCOS发生的相关性。方法按照梯度稀释的方法配置不同浓度（Ctrl、1、10和100 ng/mL）的BMP2,分别处理永生化的人颗粒细胞系（SVOG）和原代培养的人颗粒细胞（hGL）1小时和2小时,采用RT-PCR和Western Blot技术分别检测BMP2对IL-6mRNA和蛋白表达的调控作用。应用TGF-β超家族特异性受体抑制剂及siRNA技术特异性敲低相关信号通路分子的内源性表达,探索BMP2调控IL-6表达的分子机制。收集PCOS和非PCOS患者卵泡液,提取颗粒细胞后,采用RT-PCR和Western Blot技术检测IL-6的表达情况,同时采用ELISA方法检测卵泡液中BMP2和IL-6的浓度,分析二者的相关性。应用PRISM软件采用各组间单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后多重比较（Tukey multiple-comparison tests）进行数据分析。结果BMP2显著上调人颗粒细胞IL-6的表达（P＜0.0001）,但对其受体的表达无调控作用。应用TGF-β超家族特异性Ⅰ型受体抑制剂dorsomorphin和DMH-1或siALK3可完全阻断BMP2对IL-6表达的上调作用。阻断SMAD依赖的信号通路或p-NFkB信号通路均部分抑制BMP2对IL-6表达的促进作用,采用siRNA和抑制剂的方式同时阻断SMAD信号通路和p-NFkB信号通路可完全抑制BMP2对IL-6的表达的上调。PCOS患者颗粒细胞IL-6的表达较非PCOS患者显著增加,且卵泡液中BMP2和IL-6含量显著高于非PCOS患者,二者之间呈显著的正相关。结论BMP2通过SMAD介导的经典的信号通路和p-NFkB介导的非经典的信号通路参与其对IL-6表达的调控作用。BMP2可通过促进IL-6的表达参与排卵障碍性疾病PCOS的发生和发展。