论文部分内容阅读
第一部分Sonic hedgehog信号通路与皮层神经元氧化应激过程的相关性研究目的：研究氧化应激过程中,皮层神经元内源性Sonic hedgehog信号通路的变化及时空分布规律。方法：原代大鼠皮层神经元培养10天后,应用100μmol/l过氧化氢(H202)作用神经元诱导氧化应激模型,选取3h,6h,24h三个作用时间点为检测终点,用实时荧光定量PCR (Quantitative realtime PCR)的方法检测Sonic hedgehog (SHH)信号通路中的关键分子SHH, PTCH1, GLI1的mRNA水平,用免疫印迹法(Western blot)检测上述时间点三者的蛋白水平,选取100μmol/1 H2O2处理24h后的皮层神经元,用NSE和SHH两种抗体进行免疫荧光双标,用共聚焦显微镜观察SHH蛋白在皮层神经元内的分布。结果：100μmol/1 H2O2处理3h即可引起SHH, PTCH1, GLI1三者的表达均增高,其差异具有统计学意义(p<0.05),其中mRNA水平的高峰出现在6h,蛋白水平的高峰出现在24h,内源性SHH的表达主要分布在皮层神经元的细胞质。结论：氧化应激促进皮层神经元内源性Sonic hedgehog信号通路的激活,其效应具有时间依赖性,空间分布主要定位在细胞质。第二部分Sonic hedgehog信号通路在皮层神经元氧化应激中的意义目的：了解激活的Sonic hedgehog信号通路对氧化应激中皮层神经元存活的影响。方法：用100μmol/lH2O2处理皮层神经元24h作为本实验研究氧化应激的细胞模型,选用特异性阻断Sonic hedgehog的两种药物cyclopamine (20μmol/l)和5E1(10μg/ml)阻断内源性Sonic hedgehog信号通路,将皮层神经元按如下处理分为：对照组,100μmol/l H2O2组,20μmol/l cyclopamine组,100μmol/l H2O2+20μmol/lcyclopamine组,100μmol/l H2O2+10μmnol/1 5E1组,24h后用MTT方法检测各组皮层神经元的存活率。用重组的Sonic hedgehog蛋白(SHH 3μg/ml)外源性激活Sonic hedgehog信号通路,选用cyclopamine作为通路阻滞剂阻断其作用,将皮层神经元按如下处理分组：对照组,100μmol/l H2O2组,100Mmol/l H2O2+3μg/mlSHH组,100μmol/l H2O2+2Oμmol/lcyclopamine组,24h后用MTT法检测不同分组的皮层神经元的存活率,用流式细胞仪定量分析各组细胞凋亡率,用hoechst染色观察凋亡细胞形态。结果：在氧化应激的情况下,加入cyclopamine或5E1阻断内源性Sonic hedgehog信号通路的激活,引起神经元生存率相比单独应用H202组进一步下降(p<0.05),外源性激活Sonic hedgehog信号通路,可导致氧化应激中的神经元存活率增加(p<0.05),凋亡率下降(p<0.05),凋亡细胞核碎裂浓聚现象减少,该效应在应用cyclopamine阻断外源性SHH蛋白作用后可被部分逆转(p<0.05)。结论：在氧化应激中,Sonic hedgehog信号通路的激活,参与保护皮层神经元。第三部分氧化应激下由Sonic hedgehog信号通路介导的皮层神经元保护因素的研究目的：研究氧化应激下激活Sonic hedgehog信号通路后参与其神经保护作用的相关因子变化。方法：将原代培养10天的皮层神经元按如下处理分为对照组,100μmol/l H2O2组,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH组,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/lcyclopamine组,用DHE探针检测各组ROS含量,用SOD, MDA, GSH-Px, LDH试剂盒分别检测各组细胞内和培养基中相关物质的含量,用Western blot和Quantitative realtime PCR的方法检测凋亡相关分子Bc1-2和Bax的表达,用ELISA试剂盒和Quantitative realtimePCR的方法检测神经保护因子VEGF和BDNF的含量。结果：外源性激活Sonic hedgehog信号通路后,皮层神经元在氧化应激中产生的ROS含量降低,抗氧化应激的保护因子SOD, GSH-PX含量升高,细胞受损指标MDA, LDH含量下降,抗凋亡因子Bcl-2表达增加,促凋亡因子Bax表达降低,神经保护因子VEGF, BDNF表达均增加,cyclopamine阻断Sonic hedgehog信号通路后,上述效应均被减弱,以上结果经分析后具有统计学意义(p<0.05)。结论：氧化应激中Sonic hedgehog信号通路激活后,通过多种因素,包括调节氧化还原系统,减少应激有毒产物的合成,增加抗氧化应激物质的含量,提高抗凋亡因子／凋亡因子的比例,增加神经保护因子的表达,发挥神经保护作用。第四部分氧化应激中与Sonic hedgehog信号通路相关信号途径的研究目的：研究在氧化应激中参与Sonic hedgehog信号通路神经保护作用的信号途径,进一步探求其分子机制。方法：将原代培养的神经元分为四组,分别为：对照组,100μmol/l H2O2组,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH组,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/lcyclopamine组,针对三条信号途径：ERK, PI3K/Akt,p38MAPK,用Western blot方法分别检测反映通路活化的关键分子p-ERK, p-Akt, p-p38蛋白含量的变化。选择特异性阻断剂LY294002(20μmol/l)阻断PI3K/Akt信号途径,将细胞分组如下：对照组,100μmol/l H2O2组,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/lcyclopamine组,100μmol/l H2O2+3μg/mlSHH+20μmol/l LY294002组,用MTT的方法检测细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡,用western blot检测Bc1-2,Bax表达水平的变化。结果：氧化应激中外源性激活Sonic hedgehog信号通路后,p-Akt表达水平升高,p-ERK表达水平降低,p38MAPK表达水平无明显改变,阻断Sonic hedgehog信号通路或阻断PI3K/Akt信号途径后,神经元存活率降低,凋亡率增加,抗凋亡因子Bcl-2表达降低,促凋亡因子Bax表达增加,与外源性激活Sonic hedgehog信号通路的效应相比,具有统计学意义(p<0.05)。结论：Sonic hedgehog信号通路活化涉及激活PI3K/Akt信号途径和抑制ERK信号途径,PI3K/Akt信号途径可能是Sonic hedgehog信号通路发挥神经保护作用的关键,其抗凋亡的内在分子机制可能为SHH/PI3K/Bcl-2。