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Tribbles pseudokinase 3(TRIB3)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶样蛋白,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的保守结构域,但是缺乏酶促反应所必需的关键氨基酸和ATP结合区域,TRIB3无催化活性,可作为调节蛋白参与细胞增殖、分化、凋亡、糖脂代谢及肿瘤发生等过程。TRIB3不仅通过影响脂肪合成代谢的关键基因调控脂质代谢,还可由外界刺激诱导而对细胞脂质代谢产生影响。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cells,GMECs)为试验材料,克隆得到TRIB3基因编码区;通过构建干扰RNA及过表达载体,转染奶山羊乳腺上皮细胞探究TRIB3对乳腺上皮细胞脂质代谢的作用;借助实时荧光定量PCR和Western Blot等方法检测细胞内脂质代谢相关基因m RNA、蛋白的表达量,细胞内甘油三酯含量和脂滴积累的变化;并从Akt信号通路研究TRIB3基因影响脂质代谢的机制,初步探究该基因在乳腺上皮细胞中调控乳脂代谢的机制。获得如下主要研究结果:1、TRIB3基因克隆、序列分析及组织差异表达谱根据Gen Bank中山羊的TRIB3基因序列(XM＿018057667.1),用Primer Premier5.0软件设计克隆PCR特异性引物,克隆得到奶山羊TRIB3基因CDS序列,其长度为1074 bp,编码357个氨基酸,蛋白分子量为39.60 ku,等电点7.8,亚细胞定位主要存在细胞核内。同源性分析显示,西农萨能奶山羊与绵羊(Ovis aries)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)TRIB3基因核苷酸及预测的氨基酸序列同源性分别为99%、96%、71%,与绵羊亲缘关系最近;TRIB3基因在奶山羊乳腺组织中表达量最高,在肾脏组织中表达量最低。2、过表达TRIB3对乳腺上皮细胞脂质代谢的影响成功构建TRIB3过表达质粒,获得重组真核表达质粒pc DNA3.1-TRIB3,转染奶山羊乳腺上皮细胞后,TRIB3基因m RNA表达水平上调40倍左右,脂质代谢相关基因GPAM、DGAT1、PLIN1、PPARg的m RNA表达水平均显著下调(P<0.05),过表达TRIB3显著降低细胞内总甘油三酯的含量,细胞内脂滴积累降低,细胞内脂肪酸组成中C16:0显著下调,C18:0显著上调(P<0.05)。此外,(P<0.05)p-Akt/PPARg蛋白水平显著下调,PPARg启动子的活性显著下调(P<0.05)。表明过表达TRIB3基因能够通过Akt信号通路抑制乳腺上皮细胞的脂质代谢。3、干扰TRIB3对乳腺上皮细胞脂质代谢的影响针对TRIB3基因序列设计si RNA,筛选得到si RNA-588可有效降低TRIB3表达的60%,转染至奶山羊乳腺上皮细胞中,SCD1、LPL、DGAT1、PLIN1、LXRα、PPARg、SREBP1的m RNA表达水平显著上调(P<0.05),干扰TRIB3显著上调细胞内甘油三酯合成及脂滴积累,细胞脂肪酸组成中C16:0显著上调,C18:0显著下调(P<0.05)。同时,显著上调p-Akt、p-m TOR、PPARg蛋白水平的表达(P<0.05),表明TRIB3参与到Akt信号通路中,通过抑制Akt的磷酸化作用影响脂质代谢过程。通过干扰和过表达技术探究TRIB3在GMECs脂质代谢中的功能,为深入研究GMECs脂质代谢,完善乳脂代谢网络调控机制,提高羊乳品质奠定理论依据。