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研究目的研究发现Sirt1与糖尿病血管并发症相关,但其具体的分子机制目前尚未完全阐明。本研究旨在探讨Sirt1在高糖引起的内皮损伤中的作用及其潜在机制。研究方法第一部分动物实验:1、分组及建模:ApoE-/-雄性小鼠随机分为对照组(Ctrl组,n=20)、糖尿病模型组(Diabetic 组,n=20)、Ctrl+SRT1720 组(n=20)和Diabetic+SRT1720组(n=20)。Diabetic组小鼠从第4周龄开始全程给予高脂饲料喂养,待到Diabetic组小鼠8周龄时连续5天每天以50mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ),空腹血糖>16.7mmol/L表示建模成功。随机选取12周龄建模成功的Diabetic组小鼠,每日以15 mg/kg/d的剂量腹腔注射Sirt1激活剂SRT1720,连续注射12周,此组小鼠作为Diabetic+SRT1720组小鼠。每日测体重,每周测各组小鼠空腹血糖,实验结束后用鼠尾无创血压仪测各组小鼠的收缩压。各组小鼠以60mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠,将小鼠置于安乐死室中处死。2、Western Blot、RT-qPCR检测各组小鼠动脉Sirt1水平,免疫组化染色观察主动脉Sirt1水平。3、血液学指标的检测:检测各组小鼠空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)。4、分别用乙酰胆碱(ACh)和硝普钠(SNP)处理小鼠动脉环后检测内皮细胞依赖性舒张功能和非内皮细胞依赖性舒张功能。5、Western Blot检测小鼠动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)的表达水平,RT-qPCR 检测各组小鼠动脉内 ICAM-1、VCAM-1、CRP、TNF-α、IL-6 的 mRNA水平.6、Annexin V/PI-FITC法检测各组小鼠动脉内皮细胞凋亡情况。第二部分细胞实验:1、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分别用30mmol/l葡萄糖、30mmol/l甘露醇处理24小时、48小时,Western Blot检测各组HUVECs Sirt1表达情况。2、Sirt1重组腺病毒(ad-Sirt1)感染HUVECs上调Sirt1的表达,MTT法检测各组细胞活性,TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况,Western Blot检测各组细胞cleaved-Caspase3、PARP表达情况。3、DHE染色检测各组细胞活性氧(ROS)含量,JC-1染色检测各组细胞线粒体膜电位(△Ψm),Western Blot检测各组细胞Caspase9、Bax、Bad、Bcl-2、x-IAP的表达情况。4、为了验证Sirt1是否通过调控线粒体分裂抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡,我们用线粒体氧化磷酸化解偶联剂FCCP激活HG+ad-Sirt1组细胞的线粒体分裂,免疫荧光染色观察各组细胞线粒体形态大小,TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况。5、Western Blot检测各组细胞线粒体分裂蛋白:线粒体分裂因子(Mff)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、49kDa线粒体动力蛋白(Mid49)、51kDa线粒体动力蛋白(Mid51)、动力相关蛋白1(Drp1)的表达情况。6、为了验证Sirt1调控线粒体分裂的分子机制,在高糖处理前用JNK抑制剂 SP600125(SP)和 JNK 激活剂 Anisomycin(Ani)分别处理 HG+ad-Ctrl组细胞和HG+ad-Sirt1组细胞,Western Blot检测各组细胞JNK、磷酸化JNK、Mff蛋白的表达水平,免疫荧光染色观察各组细胞线粒体形态大小。7、为了验证Sirt1对内皮细胞迁移能力的影响及分子机制,我们用Jasplakinolide(Jas)抑制HG+ad-Ctrl组F-肌动蛋白的解聚,Transwell试验检测各组内皮细胞的迁移能力,Western Blot检测各组细胞F-肌动蛋白、G-肌动蛋白水平。8、为了验证高糖HUVECs中Sirt1下调的机制,RT-qPCR检测高糖组和对照组miR-195表达水平;为了验证Sirt1与miR-195之间的靶向关系,分别转染agmir-195、antagomir干扰HUVECs内miR-195水平,RT-qPCR检测各组细胞Sirt1 mRNA情况,荧光素酶报告检测系统检测miR-195对Sirt1基因是否直接调控,免疫荧光观察各组内皮细胞线粒体形态大小,细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。研究结果1、Diabetic组小鼠主动脉内Sirt1表达下降(P<0.05),体重、空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、收缩压均升高(P<0.05);Diabetic+SRT1720组与Diabetic组相比,主动脉内Sirt1水平增加(P<0.05),上述代谢相关指标均下降(P<0.05)。免疫组化结果显示与Diabetic组相比,Diabetic+SRT1720组动脉内Sirt1水平明显增加(P<0.05)。2、与Ctrl组相比,Diabetic组小鼠内皮细胞依赖性舒张功能明显减弱(P<0.05),腹腔注射SRT1720后,Diabetic+SRT120组小鼠内皮细胞依赖性舒张功能较Diabetic组改善(P<0.05),各组小鼠非内皮细胞依赖性舒张功能无明显差别;与Ctrl组相比,Diabetic组小鼠主动脉中p-eNOS表达减少(P<0.05),ICAM1、VCAM1、TNF-a、IL-6、CRP的mRNA水平升高(P<0.05),血清中GSH水平和SOD活性下降(P<0.05),MDA 水平升高(P<0.05);与 Diabetic 组小鼠相比,Diabetic+SRT1720组小鼠主动脉中 p-eNOS 表达增加(P<0.05),ICAM1、VCAM1、TNF-a、1L-6、CRP的 mRNA 水平均下降(P<0.05),GSH 和 SOD 活性升高(P<0.05),MDA 下降(P<0.05);Annexin V/PI染色流式结果显示与Ctrl组小鼠相比,Diabetic组小鼠主动脉内皮细胞凋亡率升高(P<0.05),与Diabetic组小鼠相比,Diabetic+SRT1720组小鼠内皮细胞凋亡率下降(P<0.05)。3、与Ctrl相比,高糖(HG)组Sirt1水平下降(P<0.05),且在高糖刺激48小时后Sirt1水平最低;与ad-Ctrl组对比,HG+ad-Ctrl组细胞活性下降(P<0.05).TUNEL染色结果显示凋亡细胞增加(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、PRAP蛋白水平增加(P<0.05);与HG+ad-Ctr1组对比,HG+ad-Sirt1组细胞活性升高(P<0.05),TUNNEL 染色阳性细胞减少(P<0.05),cleaved-Caspase3、PRAP 蛋白水平降低(P<0.05)。4、与 Ctrl+ad-Ctrl 组相比,DHE 染色显示 HG+ad-Ctrl 组 ROS 增加(P<0.05);△Ψm水平下降(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase9、Bax、Bad的水平升高(P<0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2、x-IAP的水平下降(P<0.05)。与HG+ad-Ctrl组对比,HG+ad-Sirt1组细胞产生的ROS减少(P<0.05);△Ψm水平升高(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase9、Bax、Bad的水平下降(P<0.05),而抗凋亡蛋白Bcl-2、x-IAP的水平增加(P<0.05)。5、与Ctrl+ad-Ctrl组相比,HG+ad-Ctrl组细胞线粒体长度下降(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05);与HG+ad-Ctrl组相比,HG+ad-Sirt1组细胞线粒体长度增加(P<0.05),细胞凋亡减少(P<0.05);与 HG+ad-Sirt1 组相比,HG+ad-Sirt1+FCCP组细胞线粒体长度下降(P<0.05),凋亡细胞增加(P<0.05)。6、与 Ctrl+ad-Ctrl 组相比,HG+ad-Ctrl 组 Mff、Drp1 和 p-JNK 蛋白表达增加(P<0.05),线粒体长度减小(P<0.05);与 HG+ad-Ctrl 组相比,HG+ad-Sirt1 组 Mff、Drp1、p-JNK蛋白水平下降(P<0.05),线粒体长度增加(P<0.05)。与HG+ad-Sirt1组相比,HG+ad-Sirt1+Ani组p-JNK、Mff蛋白表达增加(P<0.05),线粒体长度减小(P<0.05);与 HG+ad-Ctrl 组相比,HG+ad-Ctrl+SP 组 p-JNK、Mff 蛋白水平下降(P<0.05),线粒体长度增加(P<0.05)。7、与Ctrl+ad-Ctrl组相比,HG+ad-Ctrl组细胞迁移率下降(P<0.05),F-肌动蛋白表达减少(P<0.05),G-肌动蛋白表达增加(P<0.05);与HG+ad-Ctrl组相比,HG+ad-Sirt1组细胞迁移率增加(P<0.05),F-肌动蛋白表达增加(P<0.05),G-肌动蛋白表达减少(P<0.05);与HG+ad-Ctrl组相比,HG+ad-Ctrl+Jasp组细胞迁移率增加(P<0.05),F-肌动蛋白表达增加(P<0.05),G-肌动蛋白表达减少(P<0.05)。8、与Ctrl组对比,HG组miR-195水平增加(P<0.05);与Ctrl相比,转染agmir-195 组细胞 Sirt1 的 mRNA 水平下降(P<0.05);与 HG+Ctrl 相比,HG+antagomir组Sirt1的mRNA升高(P<0.05)。双荧光素酶报告系统显示miR-195可与Sirt1的3’-UTR结合。与高糖处理相似,agmir-195组较Ctrl组线粒体长度减小(P<0.05),内皮细胞迁移距离减少(P<0.05);与HG+Ctrl相比,HG+antagomir组线粒体长度增加(P<0.05),内皮细胞迁移距离增加(P<0.05)。研究结论1.在人脐静脉内皮细胞中,高糖上调miR-195从而抑制Sirt1的表达。2.在糖尿病小鼠体内,Sirt1的下调引起了代谢的异常、动脉内皮细胞功能紊乱,诱导了内皮细胞的凋亡。3.Sirt1的下调激活JNK/Mff/通路引起线粒体分裂,促进高糖诱导的内皮细胞凋亡。4.高糖环境下Sirt1的下调促进F-肌动蛋白的解聚引起内皮细胞的迁移能力的下降。