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杆状病毒是一类具囊膜包裹的双链环状DNA病毒,专一性感染节肢动物,其目前已详细记录的宿主主要包括双翅目、膜翅目和鳞翅目等昆虫。目前,对杆状病毒基因组已经有了相当多的研究,其中,IE1作为杆状病毒早期基因的一个主要转录活化子,在病毒感染早期的基因表达及病毒DNA复制中发挥了重要作用,且对病毒一些晚期基因的表达也具有转录调控作用。然而,IE1在病毒增殖复制中的具体作用及其分子调控机制目前仍不清楚,同时IE1功能作用的发挥必然依赖于其相应的功能结构域,而IE1的相关功能结构域至今仍未被完全解析。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是杆状病毒代表物种之一,能够感染具有重要经济价值的泌丝昆虫家蚕（Bombyx mori）,从而给蚕桑产业造成巨大的经济损失。因此,对BmNPV IE1在病毒增殖复制中的作用及其相关功能结构域进行研究,对于解析IE1调控杆状病毒增殖复制的分子机制有着重要意义,同时也可为家蚕抗病育种相关研究提供理论参考。本研究以BmNPV IE1为研究对象,对IE1的亚细胞定位进行探究并鉴定其核定位元件,通过截短删除分析鉴定其激活作用关键结构域,探究IE1对于BmNPV增殖复制的作用并鉴定其关键作用结构域,从而为进一步研究杆状病毒侵染及增殖复制的分子调控机制奠定基础。主要研究结果和结论如下:1.BmNPV IE1核定位元件的鉴定通过对BmNPV ie1基因进行克隆及分析,发现其ORF全长1755bp,共编码584个氨基酸,预测蛋白分子量66.92k Da,等电点为5.79。对BmNPV IE1二级结构进行预测,结果发现IE1二级结构元件在整个蛋白区域内较均匀地分布,表明该蛋白功能可能涉及整个区域,具有较丰富的功能结构域。蛋白结构域预测表明其（aa1-579）区域是一类典型的反式激活转录调控子结构域。蛋白同源序列比对发现BmNPV IE1 C端相对更加保守,可能具有更保守的功能。系统发生树分析结果显示包括BmNPV在内的GroupⅠ鳞翅目核型多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus,NPV）的IE1蛋白聚为一支,同源性较高。本研究构建了BmNPV ie1基因的真核过表达载体,转染家蚕Bm N-SWU1细胞后进行Western Blotting和免疫荧光试验。Western Blotting结果表明BmNPV ie1在家蚕细胞中成功表达,免疫荧光结果显示BmNPV IE1蛋白定位于细胞核中,由于IE1蛋白较大,超出了一般可自由出入细胞核的蛋白大小（40k Da）,表明在IE1入核转运过程中其核定位信号或元件可能发挥了重要作用。为了鉴定其可能的核定位元件,构建了IE1 N端及C端截短与中间缺失突变体并对其亚细胞定位进行分析。结果发现,IE1（aa158-208）可作为IE1的一个主效核定位元件发挥作用,当这一元件存在时能够使IE1完全定位于细胞核中;而在N端（aa1-157）和C端（aa539-559）区域则分别含有部分核定位信号或作为辅助核定位元件发挥作用,其中任一区域单独存在时不能使IE1完全定位于细胞核中,只有当两个区域共同存在时,可作为一个完整的核定位元件发挥作用,从而使IE1完全定位于细胞核中。2.BmNPV IE1激活作用关键结构域的鉴定已有研究表明杆状病毒IE1对一些病毒基因启动子具有反式活化或诱导激活作用,为了鉴定BmNPV IE1具激活作用的关键结构域,我们首先筛选了受BmNPV IE1诱导激活作用较强的病毒基因启动子。将BmNPV ie1过表达载体与P6.9、P33、P143、Bm21、Bm122、39K和VP1054等病毒基因启动子启动的Ds Red表达载体质粒共转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,72h后检测Ds Red的相对表达水平。结果发现BmNPV 39K启动子受IE1诱导激活作用相对最强,因此利用39K启动子来鉴定BmNPV IE1具激活作用的关键结构域。通过构建BmNPV IE1 N端及C端截短片段过表达载体,将其与p GL3-39K-Ds Red载体质粒共转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,通过定量检测Ds Red的相对表达水平分析其对39K启动子的诱导激活活性。结果发现IE1 N端（aa1-157）和C端（aa560-584）的删除导致IE1对39K启动子的诱导激活活性基本丧失,表明这两个区域对于IE1诱导激活活性是必要的;进一步将IE1 N端及C端截短片段融合表达并进行分析,结果表明IE1（aa1-157&209-584）是IE1诱导激活活性所需的,为BmNPV IE1激活作用关键结构域。3.BmNPV IE1影响病毒增殖复制关键结构域的鉴定为了鉴定BmNPV IE1对于病毒增殖复制的作用及其关键作用结构域,利用本实验室保存的BmNPV野生型bacmid,并通过同源重组及Bac-to-Bac转座技术构建了BmNPV ie1缺失型及回补型bacmid,并进行了后续研究。将三种bacmid分别转染家蚕Bm N-SWU1细胞12、24、48及72h后,进行荧光细胞数观察、流式细胞术分析并统计EGFP阳性细胞数,同时从转录水平对BmNPV me53、gp64、vp39及p10基因的表达进行定量检测,以及从蛋白翻译水平检测病毒VP39蛋白表达量。结果表明BmNPV野生型bacmid b Bm WT能够增殖复制,ie1缺失型bacmid b Bmie1KO不能增殖复制,而ie1回补型bacmid b Bmie1KO-IE1（HA）能够恢复增殖复制的能力,表明BmNPV IE1在病毒增殖复制中发挥了关键作用,为病毒增殖复制所必需。为了鉴定IE1影响BmNPV增殖复制的关键作用结构域,利用之前构建的IE1截短删除突变体,与BmNPV ie1缺失型bacmid b Bmie1KO共转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,转染后在不同时间点显微镜观察荧光细胞扩散情况,并在转染后96h提取细胞基因组检测病毒gp41拷贝数。结果发现b Bmie1KO与IE1全长及IE1（aa1-579）共转染后能够支持其增殖复制,而IE1 N端与C端截短突变体IE1（aa23-584）和IE1（aa1-559）以及截短融合突变体IE1（aa1-157&209-584）不能支持b Bmie1KO增殖复制。由于IE1（aa1-559）没有反式激活活性,因此不能确定是否由于（aa560-584）的删除导致IE1激活作用丧失从而影响了其支持病毒增殖复制的能力,但IE1（aa23-584）和IE1（aa1-157&209-584）仍具有较显著激活活性却不能支持b Bmie1KO增殖复制,表明N端（aa1-22）和（aa158-208）区域对于IE1支持病毒增殖复制是必要的。综上所述,本研究鉴定到BmNPV IE1（aa158-208）是IE1的一个主效核定位元件,（aa1-157）和（aa539-559）为其辅助核定位元件;（aa1-157&209-584）为IE1发挥正常的激活活性所必需,是其激活作用关键结构域;BmNPV IE1是病毒增殖复制所必需的,且N端（aa1-22）区域及其主效核定位元件（aa158-208）对于IE1支持病毒增殖复制是必要的,为IE1影响病毒增殖复制的关键作用结构域。本研究进一步丰富了杆状病毒IE1的功能及其结构域研究,同时也为进一步解析杆状病毒增殖复制的分子调控机制奠定基础。