体细胞克隆猪生产及植酸酶转基因克隆胚的构建

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猪属于单胃动物,不能利用植酸酶,只能随粪便排出体外,由此加重了畜牧业发达地区的磷污染。猪体细胞核移植转基因技术在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力,同时还有望在猪育种上应用,甚至生产“环保猪”。   主要研究结果如下:   1.建立了枫泾猪成年耳成纤维细胞系、35d胎儿成纤维细胞系、输卵管上皮细胞系,分离并培养了猪卵泡液中的颗粒细胞;且比较了脂质体介导法中脂质体含量、DNA含量和孵育时间对转染效率的影响。结果显示:当四种细胞系在24孔板内汇达到85%~90%时,用1.0μgDNA和2.4μL脂质体孵育4h转染YM6552质粒效率最高。且四种细胞系对脂质体介导法条件要求一致,其中胎儿成纤维细胞的转染效率最高。   2.在体细胞核移植转基因过程中,本实验通过LipofectamineTM2000介导YM6552质粒转染四种供体细胞,用G418筛选阳性细胞。筛选出来稳定的转染YM6552的细胞做供核细胞,获得了表达绿色荧光蛋白的重构胚胎。在构建重构胚胎的同时比较了四种转基因的供核细胞对重构胚体外发育的影响。结果表明:胎儿成纤维细胞在转染YM6552质粒后获得了最高的卵裂率和囊胚率。   3.经胚胎移植,获得了87.5%的怀孕率,8头母猪中只有一头母猪于移植后第一个情期返情,另外7头移植母猪中有3头怀孕至终期,并产下6头克隆猪,其中四头存活,目前生长状况良好。与以前胚胎移植相比,本次胚胎移植实验进行了如下改变:第一,每次移植了更多数目的胚胎,平均每头受体胚胎数目约为300-400枚之间,较高数目的胚胎一方面增加了可能附植的胚胎数目,增强了妊娠信号,从而提高了怀孕率。第二,胚胎移植过程中,挑选体型和健康状态较好的受体母猪,并在较适时机进行移植,可能足核移植效率提高的关键。
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