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研究背景:肝脏是人体最重要的器官之一,一方面它是机体物质代谢的中心,另一方面又是一个重要的免疫器官,因此肝脏的损害将严重影响人们的健康状况。据报道,大约15%的肝脏疾病为遗传因素导致,而85%的肝脏疾病为环境因素所致,其中以肝炎病毒、酒精和化学物质三大因素所引起的肝损伤最为多见。各种原因引起的肝细胞损伤可导致肝功能受损,最终引起肝功能衰竭,造成不可逆的肝细胞损伤,对人类生命具有极大的危害性。我国是肝脏疾病发生的大国,肝损伤是常见的临床问题,肝功能衰竭的死亡率高达40%,因此,治疗与纠正肝损伤已经成为各型肝病的主要治疗措施,而寻找新的高效安全的拮抗肝损伤的药物则是当前医学研究领域亟待解决的问题。肝损伤的机制比较复杂,治疗困难。新近的研究表明,非特异性炎症细胞的肝内汇聚是多种肝损伤的重要机制,而新发现的细胞因子—高迁移率族蛋白B1在趋化炎细胞汇聚中起重要作用。肝损伤的另一重要机制是肝脏损伤时肝脏微循环障碍,其主要参与细胞是肝窦内皮细胞。其表达细胞表面粘附分子与血小板的粘附及炎症细胞肝内汇聚有关。针对肝损伤,过去采用特异性抗体和受体拮抗剂的治疗,因种种原因尚未在临床应用。长期的临床探索证实传统的中草药对肝病有独特的治疗效果,这其中赤芍（Radix Paeoniae Rubra）以其显著的保肝、退黄作用受到了国内外学者的广泛关注。赤芍的主要有效成分是芍药苷,体内实验证实有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环等作用。那么,芍药苷抗炎及改善微循环对肝损伤的保护作用机制是什么?是否通过拮抗HMGB1来实现?本研究将从以下两部分实验予以证实。第一部分实验芍药苷对小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1释放和表达的抑制作用目的:通过观察芍药苷对内毒素刺激的小鼠腹腔巨噬细胞（RAW264.7）高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达的影响,以探讨芍药苷的抗炎作用机制,为进一步研究开发防治肝病的药物提供理论依据。方法:1.小鼠腹腔巨噬细胞的传代培养:复苏后的RAW264.7细胞用含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10%新生牛血清、2mol/L谷氨酰胺、10μg/ml多粘菌素B的RPMI1640培养液中培养,同时放置在37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞融合80%后,以0.25%胰蛋白酶+1mmol/L EDTA溶液消化传代。2.台盼蓝拒染实验鉴定细胞活性:将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液,取0.5ml0.4%台盼蓝染液、0.3mlHBSS和0.2ml细胞悬液充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液,注入血细胞计数板小室,计数其中着色的细胞。3.细胞免疫组化实验分为三组:对照组、LPS刺激组（LPS 100ng/ml）、芍药苷组（LPS100ng/ml+芍药苷0.625mg/ml）,采用免疫组化方法检测小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1的表达。4.采用Western blot方法检测培养上清液HMGB1的含量。结果:台盼蓝拒染实验表明各实验组RAW264.7细胞活力均大于95%,实验所加各种物质没有影响细胞的活力,排除细胞坏死HMGB1的被动释放因素。LPS刺激RAW264.7细胞20h后免疫组化结果显示:正常培养的RAW264.7细胞未刺激时HMGB1聚集在细胞核内;LPS组内毒素刺激20h后大部分细胞胞核HMGB1特异性染色变淡,胞核染色变蓝,胞浆染色加深,表明HMGB1从胞核转移到胞浆;芍药苷组细胞体积改变不明显,大部分细胞胞核HMGB1特异性染色深,胞浆染色浅。表明加入芍药苷药液后HMGB1释放大部分抑制。3.培养上清液中HMGB1含量变化检测:对照组细胞上清液中未检测到HMGB1;芍药苷组HMGB1含量显著低于LPS组,但高于对照组（F=827,P＜0.01）。结论:芍药苷通过抑制小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1的释放和表达,可能减轻肝损伤时肝脏的炎症反应,对急性肝损伤发挥保护作用。第二部分实验芍药苷对血管内皮细胞HMGB1、ICAM-1释放的抑制作用目的:通过观察芍药苷对LPS诱导的脐静脉内皮细胞（ECV304）高迁移率族蛋白1（HMGB1）和细胞间粘附分子（ICAM-1）表达的影响,以探讨芍药苷对内皮细胞发挥保护作用的途径,从而为进一步揭示的芍药苷药理作用机制提供理论依据。方法:1.脐静脉内皮细胞的传代培养:复苏后的ECV304细胞用含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10%新生牛血清、2mol/L谷氨酰胺、10μg/ml多粘菌素B的RPMI1640培养液中培养,同时放置在37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞融合80%后,以0.25%胰蛋白酶+1mmol/L EDTA溶液消化传代。2.台盼蓝拒染实验鉴定细胞活性:将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液,取0.5ml0.4%台盼蓝染液、0.3mlHBSS和0.2ml细胞悬液充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液,注入血细胞计数板小室,计数其中着色的细胞。3.细胞免疫组化实验分为三组:对照组、LPS刺激组（LPS 100ng/ml）、芍药苷组（LPS100ng/ml+芍药苷0.625mg/ml）,采用免疫组化方法检测脐静脉内皮细胞HMGB1、ICAM-1的表达。结果:台盼蓝拒染实验表明各实验组ECV304细胞活力均大于95%,实验所加各种物质没有影响细胞的活力,排除细胞坏死HMGB1的被动释放因素。脐静脉内皮细胞HMGB1、ICAM-1免疫组化结果显示:正常培养的脐静脉内皮细胞未刺激时HMGB1聚集在细胞核内,ICAM-1微弱表达;LPS刺激20h后大部分细胞HMGB1从胞核转移到胞浆,ICAM-1表达明显增多;加入芍药苷药液后HMGB1释放大部分抑制,ICAM-1的表达明显减少。结论:芍药苷通过抑制血管内皮细胞HMGB1、ICAM-1的释放,可能对急性肝损伤时肝脏微循环障碍有改善作用。