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背景和目的成人骨髓不仅是正常造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)赖以生存的微环境,也是白血病微小残留病变(minimal residual disease, MRD)潜伏的天然庇护所和复发的根源。研究表明,骨髓内微环境是一个低灌注、低氧分压的环境,在这个高度特异的微环境中氧浓度仅为1-6%。成人造血干细胞定居在骨髓中的干细胞龛(stem cell niche)中,龛内的氧浓度非常低,但造血细胞的耗氧量却很高,因此,HSCs处于一个严重缺氧的环境中,低氧可能直接参与了对HSCs自我更新和多向分化潜能的调控。造血干细胞已经被广泛应用于恶性血液病、部分实体恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗,但目前的HSCs培养和扩增大多数是在环境氧浓度(21%O2)状态下进行的,HSCs暴露在高氧浓度中,反应性氧自由基会堆积在线粒体内导致细胞的氧化损伤,对细胞的扩增潜能产生不利影响,从而无法高效地对HSC进行体外扩增,这在一定程度上限制了HSC的临床应用。白血病(leukemia)是来源于造血干祖细胞的恶性克隆性血液系统疾病,目前联合化疗仍是白血病的基本治疗方法。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是成人急性白血病中最常见的类型,在AML患者中联合化疗后的完全缓解(complete remission,CR)率仅有50-80%,而白血病细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是导致治疗失败的最主要原因。耐受化疗的白血病细胞往往在治疗后潜伏下来,在骨髓中形成微小残留病变,成为白血病复发和多药耐药的根源。骨髓中低氧的微环境可能为这些恶性细胞提供一个天然的庇护所。本研究旨在探讨低氧培养对造血干祖细胞的自我更新及增殖分化的影响,为体外高效培养和扩增干细胞提供实验室依据；同时探讨了低氧条件对于白血病细胞多药耐药性的的影响,及在低氧状态下这些恶性干细胞性的变化,了解二者之间的联系,从而为白血病多药耐药的研究提供一个新思路。材料和方法采集人外周血单个核细胞,采用免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,将等量细胞分为低氧组和正常氧组,分别在1%氧浓度和正常氧浓度(21%)下培养7天后,检测细胞扩增总数,流式细胞仪检测细胞表型CD34、CD45和CD61及测定各亚群数量；实时荧光定量PCR (Taqman)检测低氧诱导因子1α (HIF-1α) mRNA的表达；并将细胞接种至甲基纤维素半固体培养基,观察BFU-E、 CFU-GM和CFU-GEMM细胞集落的形成情况。采用逐步提高培养液中阿霉素浓度的方法长期诱导建立K562耐药株(K562/DOX),并检测该耐药株对其他化疗药物的耐药性。将K562/DOX细胞和野生株(K562/WT)分别在1%氧浓度和正常氧浓度(21%)下进行培养后,MTT法检测两种细胞株在不同氧浓度下耐药性的变化,观察两株细胞在不同氧状态下的生长曲线,Western blot检测缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α,以及干细胞性标志物Oct4和CD133的表达,流式细胞仪检测ABC家族转运蛋白ABCG2和干细胞表型CD34。此外,Western blot检测Smad2蛋白的磷酸化水平；并使用不同浓度的TGF-β受体I激酶抑制剂SD-208抑制TGF-β/Smad细胞信号传导通路,Western blot方法观察K562/DOX细胞中Oct4和CD133蛋白表达在信号通路被抑制前后的变化。结果1.人外周血CD34+细胞分别经过1%和21%氧浓度培养7天,低氧组的细胞总数为(9.2±3.37)×106,正常氧组的细胞总数为(12.1±5.4)×106,两组比较差异显著(t=2.749,P<0.05)。低氧组的CD34+细胞所占的比例为(3.0±2.71)%,正常氧组CD34+细胞所占的比例为(0.9±1.95)%,两组比较差异显著(t=4.805,P<0.05)：并且低氧组的CD34+细胞总数为(0.374±0.3)×106,正常氧组的CD34+细胞总数为(0.1±0.23)×106,两组相比也有显著性差异(t=3.513, P<0.05)。CD45+和CD61+细胞比例、数量在二组比较均无显著差异(P>0.05)。2.低氧组细胞的HIF-la mRNA表达比正常氧组增高(39±18)%,两组比较差异显著(t=6.280,P<0.05)。3.干／祖细胞集落形成实验结果显示低氧组的细胞集落总数为43.5±22.9/103细胞,正常氧组的细胞集落总数为30.5±27.9/103细胞,两组比较无显著统计学差异(P>0.05)；低氧组爆式红系集落BFU-E的数量为17.5±11.2/103细胞,而正常氧组BFU-E的数量为6.5±16.1/103细胞,两组相比差异显著(t=2.327,P<0.05)；对于由较早期祖细胞形成的粒系、单核系、红系和巨核系的混合集落CFU-GEMM,低氧组的集落生成数量为1±1.6/103细胞,正常氧组的集落生成数量为0±0.7/103细胞,两组比较差异显著(t=2.764,P<0.05)；而CFU-GM集落计数显示低氧组和正常组之间无明显统计学差异(P>0.05)。4.采用逐步提高阿霉素浓度的方法诱导建立的K562多药耐药细胞(K562/DOX)中,检测阿霉素的IC50值为(78.53±15.25)μM,而野生株(K562/WT)细胞中阿霉素的IC50值为(1.24±0.24)μM,两株细胞比较差异显著(t=9.852,P<.001); K562/DOX细胞中长春新碱的IC50值为(1.636±0.232)μM,而K562/WT细胞中则为(0.0214±0.001)μM,两株细胞比较差异显著(t=12.037, P<0.001); K562/DOX细胞中阿糖胞苷的IC50值为(109.94±16.85)μM,而K562/WT细胞中则为(63.02±4.68)μM,两株细胞比较差异显著(t=4.648,P<0.01)。并且流式结果显示在K562/DOX细胞中ABC转运蛋白ABCG2的表达阳性率为(6.2±1.7)%,而K562/WT细胞中则为(2.6±1.8)%,两株细胞比较差异显著(t=3.195,P<0.05)。5.低氧组的K562/WT细胞中阿霉素IC50值为(3.32±0.26)μM,而正常氧组的K562/WT细胞中阿霉素的IC50值为(1.24±0.24)μM,两组比较差异显著(t=10.211,P<0.05)；对于K562/DOX细胞,低氧组的阿霉素IC50值为(88.98±15.42)μM,而正常氧组为(78.53±15.25)μM,两组比较无显著差异(P>0.05)。同样,低氧组的K562/WT细胞中ABCG2蛋白阳性率为(15.9±4.8)%,而正常氧组为(2.6±1.8)%,两组比较差异显著(t=4.766,P<0.05)；对于K562/DOX细胞,低氧组ABCG2蛋白阳性率为(20.6±2.3)%,正常氧组为(6.2±1.7)%,两组比较差异显著(t=8.804,P<0.05)。6.细胞生长曲线显示低氧明显抑制了K562/WT细胞的生长(td5＝3.286,P<0.01; td6=2.512,P<0.05; td7=12.84,P<0.001);但K562/DOX细胞在低氧状态下的生长与正常氧浓度相比无明显变化(P>0.05)。这与HIF2a蛋白的结果一致：在K562/WT细胞中,低氧上调HIF2a蛋白的表达,与正常氧组比较有显著性差异(t=2.717,P<0.05)；而低氧组K562/DOX细胞的HIF2α表达并没有出现明显上调,与正常氧组相比无显著性差异(P>0.05)。7.流式结果显示K562/DOX细胞CD34表型的阳性率为(1.6±0.6)%,K562/WT细胞为(0.4±0.1)%,两组比较差异显著(t=3.816,P<0.05)。在K562/DOX细胞中,低氧将CD34蛋白表达从(1.6±0.6)%显著性上调至(12.4±1.9)%(t=9.265,P<0.05)；在K562/WT细胞中,则从(0.4±0.1)%显著性上调至(9.1±2.4)%(t=6.368,P<0.05)；因此低氧组中K562/WT细胞CD34表型的上调较K562/DOX细胞中的上调程度明显,两种细胞株比较差异显著(t=3.084,P<0.05)。此外,低氧组中K562/WT细胞的Oct4和CD133蛋白表达较正常氧组明显升高,两组比较差异显著(tOct4=3.229,tCD133=2.569, P<0.05);而对于K562/DOX细胞,低氧组Oct4和CD133蛋白的表达与正常氧组比较无显著统计学差异(P>0.05)。因此,K562/WT细胞中低氧上调Oct4和CD133的作用比在K562/DOX细胞中的作用明显增强,两组细胞相比差异显著(tOct4=2.876, tcD133=3.617,P<0.05)。8. K562/DOX细胞中Smad2的磷酸化水平与K562/WT细胞株相比明显增高,两组差异显著(t=5.364,P<0.05)。并且低氧组中Smad2磷酸化水平在两种细胞株中均显著性增加,组间比较差异显著(F=5.132,P<0.05)。9.在K562/DOX细胞中抑制TGF-β受体I激酶的活性从而阻断TGF-β/Smad传导通路后,低氧状态下Oct4和CD133蛋白的表达出现了显著性的下调(FOct4=8.103, FCD133=17.43,P<0.05),并且其下调程度呈剂量依赖性。结论1.低氧状态能够维持和增强造血干祖细胞的自我更新能力,推测造血干祖细胞在低氧的微环境可能更倾向于保持静止不分化的状态,而较高的氧分压不利于干细胞性的维持,可能会使干祖细胞更趋向于分化。2.低氧状态也促进了造血干细胞向红系祖细胞方向的分化。3.低氧微环境对于造血干／祖细胞的自我更新和增殖分化起着十分重要的调控作用,这种调控作用有可能是通过HIF-1α的激活来实现的。4.造血干细胞的培养可以通过减低氧浓度和调控转录因子HIF-1α的方法来提高体外扩增的效能。5.低氧微环境带来的的选择压力能够促进白血病细胞干细胞性的表达,从而有助于细胞多药耐药性的产生和进展。6. TGF-β/Smad信号传导通路的活化可能参与了低氧对于白血病细胞的干细胞性和多药耐药性的调节。7.针对白血病干细胞表型的免疫治疗和对TGF-β/Smad信号传导通路的抑制可能成为逆转细胞多药耐药的新靶点。