乳腺癌转移是造成患者死亡的主要原因之一。大量研究结果表明,花生四烯酸异常代谢和ERK信号传导途径与乳腺癌具有密切的关系。本研究在实验室前期研究发现Gi/o/PLC/PKC/p-ERK1/2/MLCK/p-MLC明显促进乳腺癌转移的基础上,针对花生四烯酸代谢途径相关酶与该途径的ERK等关健信号的关系进行了深入细致的研究,拟从代谢的角度进一步揭示了乳腺癌转移的分子机理,主要研究内容如下： 一、花生四烯酸代谢相关酶和p-ERK1/2与乳腺癌转移的关系 实验室前期应用蛋白质组学方法及基因表达谱芯片发现,与MCF-7细胞相比,在高转移潜能乳腺癌细胞LM-MCF-7中甘油磷酸激酶I(phosphoglyceratekinase 1)、磷酸甘油醛异构酶(triosephosphate isomerase)、烯醇酶(enolase)和磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)等多个与糖代谢途径密切相关的蛋白表达上调,并且花生四烯酸(AA)代谢途径相关酶酶cPLA2和COX-2的基因也明显上调。文献报道花生四烯酸代谢是糖代谢的重要组成部分,上述结果从蛋白水平和基因水平上提示AA代谢可能与乳腺癌转移相关。因此,我们进一步应用RT-PCR和Western blot方法检测了AA代谢酶cPLA2、COX-2、5LOX和12R-LOX在MCF-7、LM-MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达情况。 结果显示,与MCF-7细胞相比,在LM-MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中上述AA代谢酶的蛋白和基因表达水平明显上调。结果提示,从代谢可能与乳腺癌转移相关。本研究应用免疫印迹方法进一步验证了p-ERK1/2在LM-MCF-7、MDA-MB-231及MCF-7细胞中的表达差异。结果显示,高转移乳腺癌细胞系LM-MCF-7和MDA-MB-231中p-ERK1/2的表达水明显高于MCF-7细胞。我们进一步对临床手术的乳腺癌组织、癌旁组织和转移淋巴结组织中COX-2、5-LOX 12R-LOX和p-ERK1/2的表达进行了检测。结果显示,与癌旁组织组织相比,COX-2、5-LOX 12R-LOX和p-ERK1/2在乳腺癌组织及转移淋巴结组织中的阳性表达率明显升高,差异具有显著性(P<0.01,X2检验),在转移淋巴结组织中的强阳性表达率显著高于乳腺癌组织(P<0.01,X2检验)。以上结果提示,AA代谢酶和p-ERK1/2与乳腺癌转移密切相关并且具有协同性。 二、花生四烯酸代谢和ERK信号传导途径在乳腺癌转移中的相互作用关系 为了研究ERK信号途径对AA代谢的影响,我们首先应用Gi/o、p-ERK1/2和PKC的抑制剂PTX、PD98059和Calphostin C分别作用LM-MCF-7和MDA-MBA-231细胞,检测其对AA代谢酶的影响。RT-PCR和Western bolt结果显示,上述抑制剂均可以明显抑制cPLA2的表达水平；p-ERK1/2的特异性抑制剂PD98059可以明显抑制AA代谢途径相关酶COX-2、5-LOX和12R-LOX基因和蛋白的表达水平。结果提示ERK信号途径可以促进AA的释放和代谢。 为了证实AA代谢产物可能通过激活Gi/o蛋白进一步活化p-ERK1/2,我们应用外源AA作用于LM-MCF-7细胞,Western bolt结果显示,外源AA可以明显上调细胞内p-ERK1/2的表达水平,同时我们发现Gi/o蛋白的特异性抑制剂PTX可以阻断外源AA对细胞内p-ERK1/2表达的上调。我们也发现应用AA代谢酶cPLA2、COX和LOX特异性抑制剂AACOCF3、Indomethacin(Indo)和NDGA均可下调LM-MCF-7细胞细胞中p-ERK1/2的表达水平。以上结果表明,AA代谢产物可以通过作用Gi/o蛋白激活下游ERK信号途径,进而增强乳腺癌细胞增殖和迁移的能力。 综上所述,AA代谢酶和p-ERK1/2与乳腺癌转移密切相关并且具有协同性,同时p-ERK1/2和AA代谢可以通过相互促进的方式保持高转移乳腺癌细胞的高增殖和迁移能力。上述研究进一步阐明了乳腺癌转移的分子机制,为乳腺癌转移的早期诊断、预防和治疗奠定了理论基础。