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蛋白质类药物具有低毒性,靶向性和药效好的特点,因此治疗脑部疾病的蛋白类药物的研发一直是研究热点。尽管血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）限制了潜在的神经毒性物质进入大脑,但它也是将治疗药物送入中枢神经系统以治疗疾病的主要障碍。血脑屏障具有较低的胞吞作用和紧密的连接（TJ）,该连接在内皮膜之间形成密封与高跨内皮电阻,造成了极低的渗透性,极大地限制了药物从血液到脑内的旁细胞扩散。中枢神经系统蛋白质类药物的开发难点之一在于克服血脑屏障的低渗透性。一方面,与反式转录激活因子（TAT）融合表达是改善脑靶向传送的一种方法;另一方面,鼻内给药途径是一种无创便捷的方法,可将药物从鼻腔绕过BBB直接输送至大脑。鼻粘膜上有丰富的神经节苷脂GM1受体,霍乱毒素的B亚基五聚体（CTB）5能与神经节苷脂GM1受体特异性结合,增强胞吞作用。因此本研究将增强型荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）和重组表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）通过基因工程方法分别融合表达到CTA2（霍乱毒素的A2亚基）的N端,再与（CTB）5体外复性,设计并制备了霍乱毒素样嵌合蛋白,研究了其体内外生物学活性以及脑靶向治疗效果和入脑效率。研究内容:1.获得含增强型绿色荧光蛋白的霍乱毒素样嵌合蛋白EGFP-CTA2-TAT/（CTB）5的方法:使用Oligo 7软件设计引物序列、构建质粒载体并转化得到重组大肠杆菌,融合蛋白EGFP-CTA2-TAT和CTB分别由上清和包涵体表达;初步纯化后分别通过透析复性和柱层析复性纯化得到纯度较高的蛋白质,通过在体外用柠檬酸-Tris碱变复性方法获得霍乱毒素样嵌合蛋白EGFP-CTA2-TAT/（CTB）5。2.含增强型绿色荧光蛋白的霍乱毒素样嵌合蛋白EGFP-CTA2-TAT/（CTB）5的入脑效果研究方法:小鼠鼻内给药CTB与EGFP-CTA2-TAT/（CTB）5后分别在0、15、30、60分钟麻醉处死。取整脑进行脑匀浆,并通过荧光分光光度计检测脑匀浆上清的荧光值。3.对嵌合蛋白的入脑时间和部位的研究方法:小鼠鼻内给药EGFP-CTA2-TAT/（CTB）5后分别在0、5、30分钟麻醉处死,分别取嗅球、小脑、海马区、下丘脑和大脑皮层进行脑匀浆,并通过荧光分光光度计检测脑匀浆上清的荧光值。4.获得含表皮生长因子的霍乱毒素样嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/（CTB）5的方法:使用Oligo 7软件设计引物序列、构建质粒载体并转化得到重组大肠杆菌。融合蛋白EGF-CTA2-TAT使用包涵体表达的纯化方法得到,然后分别通过透析复性、柱层析纯化得到两种纯度不同、活性不同的EGF-CTA2-TAT,两者均与CTB蛋白通过在体外用柠檬酸-Tris碱变复性方法获得含EGF的霍乱毒素样嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/（CTB）5。5.以小鼠胚胎成纤维细胞增殖实验和GM1-ELISA实验分别验证嵌合蛋白的EGF和CTB活性。6.含表皮生长因子的霍乱毒素样嵌合蛋白对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导神经炎小鼠模型的治疗作用研究方法:对小鼠滴鼻给药后,腹腔注射LPS诱导神经炎。21天后通过莫里斯水迷宫和十字高架迷宫实验检测EGF-CTA2-TAT/（CTB）5嵌合蛋白治疗模型鼠学习、记忆和焦虑缺陷的效果。7.使用ELISA试剂盒检测模型鼠给药与否对体内TNF-α,NF-κB和ROS等相关因子水平的影响作用。研究结果:1.通过原核表达、体外酸碱变复性组装,成功制备了分别含增强型绿色荧光蛋白和表皮生长因子的霍乱毒素样嵌合蛋白;2.鼻腔给药5分钟后,含增强型绿色荧光蛋白的霍乱毒素样嵌合蛋白可被定向递送到嗅球,小脑和海马。之后大约30分钟内扩散到下丘脑,但没有到达大脑皮层;3.含表皮生长因子的霍乱毒素样嵌合蛋白与市售EGF具有同样的刺激小鼠胚胎成纤维细胞增殖的能力,且保留有CTB亚基结合GM1受体的能力,嵌合前后无明显变化;4.成功建立了LPS诱导神经炎小鼠模型,并在此模型上确证了含表皮生长因子的霍乱毒素样嵌合蛋白具有治疗LPS引起的学习、记忆和焦虑缺陷的活性;5.机理研究证明,含表皮生长因子的霍乱毒素样嵌合蛋白可降低模型小鼠的TNF-α,NF-κB和ROS水平。结论:本研究在获得一个能够有效经鼻入脑、治疗脑部神经炎的候选大分子药物以外,也表明,霍乱毒素样嵌合蛋白是通过鼻内给药有效地将蛋白质类药物输送到大脑的有力工具。在这项研究中介绍的传递系统提供了一个分子设计模式,通过该模式可以构建系列具有脑靶向活性的大分子蛋白质药物,用于脑部疾病的药物开发。