背景和目的:卵巢癌是女性盆腔生殖器官三大恶性肿瘤之一,其发病率仅次于宫颈癌、子宫内膜癌而位居第三位,近年来卵巢恶性肿瘤的发病率一直持上升的趋势,每年以1%0的速度增长。由于卵巢位于盆腔的深处,缺少特异性的早期检测指标和诊断手段,因此可能导致在发现卵巢癌时,其临床分期已较晚或已发生转移,所以卵巢癌的治疗效果欠佳,预后比较差。近年来随着肿瘤细胞减灭术和化疗水平的不断提高,卵巢癌患者的死亡率也逐渐有所改善,但因为卵巢癌患者被发现多以致晚期而又可能得不到及时有效的治疗,其晚期卵巢癌患者的5年生存率不足30%,目前其死亡率高居妇科三大恶性肿瘤之榜首。卵巢癌发生及发展是一个多途径、多阶段、多机制的较为复杂的过程。虽然既往已有很多研究试图来阐述卵巢癌致病因素,但卵巢癌生物学行为的分子机制仍不明确。越来越多的证据已表明:抑癌基因失活或原癌基因激活以及它们之间的相互作用失去平衡是卵巢癌发生发展的分子基础。因此,研究和探索卵巢癌的发病机制,进一步明确卵巢癌分子生物细胞学的恶性行为,寻找更为有效的监测卵巢癌分子生物学指标,研究与卵巢癌相关的重要基因及其介导的信号分子机制通路将是当前卵巢癌临床治疗所面临和亟待解决的严峻课题。异位病毒整合位点1(ectopic viral integration site-1,Evil)基因是一个逆转录基因位点,其编码的蛋白是带有锌指结构的转录因子,定位于染色体3q26,他的基因长度是60000bp,其中外显子16个,是SET/PR转录因子家族中的一员。Evil基因作为一个逆转录因子,通过特定的GACMGATA序列与目标基因的DNA相结合,从而发挥它对其下游基因表达的抑制或促进功能。最早发现Evil基因是一种与恶性髓系肿瘤关的致癌性转录因子,在哺乳动物生长发育过程中起着非常重要的作用。虽然过去大量研究已证实Evil基因与血液肿瘤的发生发展关系密切,随着对Evil基因研究的深入,Evil基因在其他实体肿瘤领域内的作用不断被发现。新近研究表明,其在实体恶性肿瘤的浸润和转移中亦起着重要作用,例如,在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤中发现Evil高表达,并且和患者的预后呈负相关。目前,国内外尚无Evil与卵巢癌生物学行为及化疗敏感性的研究报道。Evil在卵巢癌中的表达情况如何,是否参与卵巢癌的发生和发展,是否参与卵巢癌的化疗耐药等问题亟待解决。因此,本课题拟研究Evil在卵巢癌中的表达情况,研究调控其表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、血管生成能力及化疗药物敏感性的影响,初步探讨Evil对卵巢癌细胞生物学行为和化疗敏感性影响的分子机制,以期为卵巢癌患者基因治疗提供新的生物学靶目标。本研究分为以下三个部分:第一部分:Evil在卵巢癌中的表达及其意义;第二部分:抑制Evil表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响及其分子机制的初步探讨;第三部分:抑制Evil表达对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响。第一部分:Evil在卵巢癌中的表达及其意义目的:通过检测Evil在卵巢癌中的表达水平,结合患者临床病例资料,分析其表达与卵巢癌患者临床病理参数间的关系。方法:1.采用免疫组化和免疫荧光技术检测上皮性卵巢癌组织、良性肿瘤组织,正常卵巢组织中Evil蛋白的表达。2.采用原位杂交技术检测上皮性卵巢癌组织、良性肿瘤组织,正常卵巢组织中Evil mRNA的表达。3.采用Western blot检测不同卵巢细胞内Evil蛋白的表达。4.分析Evil表达与卵巢癌患者临床病理参数间的关系。结果:1.在正常卵巢上皮组织内,Evil蛋白中无表达,其主要表达于在良性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织的细胞核上,Evil基因免疫组化阳性表达的结果是呈棕黄色颗粒,免疫荧光阳性表达的结果是呈绿色荧光颗粒。Evil蛋白在正常卵巢上皮组织中的阳性表达率为0%(0/20),着色强度0级;在良性卵巢组织中的阳性表达率为18%(4/22),着色强度1级;在上皮性卵巢癌中的阳性表达率为55%(30/55),着色强度为3级。与正常卵巢上皮组织、良性卵巢肿瘤组织相比,Evil蛋白的阳性表达率在上皮性卵巢癌组织内明显较高,存在显著区别P<0.05。Evil蛋白在Ⅰ～Ⅳ期上皮性卵巢癌标本组织中相对表达的阳性率分别21.41%,48.65%,65%和91.42%,各组之间比较均具有统计学差异(x 2=6.024,P<0.05)。卵巢癌分期越晚,Evil蛋白表达的阳性率越高。2.在正常卵巢上皮组织中Evil mRNA无表达,Evil主要存在于在良性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织内的细胞核中,阳性表达呈棕黄色颗粒。Evil mRNA在正常卵巢上皮组织中的阳性表达率为0%(0/20),着色强度0级;在良性卵巢组织中的阳性表达率为14%(3/22),着色强度1级;在上皮性卵巢癌中的阳性表达率为47%(26/55),着色强度为2级。相比正常卵巢上皮组织,良性卵巢肿瘤和上皮性卵巢癌组织Evil mRNA的阳性表达率与其着色程度明显较高,且区别显著,P<0.05。3.Western blot结果显示,与正常人卵巢细胞HOSEpiC相比,卵巢癌细胞OVACAR3,SKOV3,A2780,ES2,Caov3 和 COC1,Evil 蛋白的相对表达量分别为:0.32±0.01,0.53± 0.02,0.49 ±0.01,0.51 ±0.01,0.31 ±0.01 和 0.32±0.02,卵巢癌细胞的Evil蛋白表达量与正常卵巢细胞相比,具有统计学差异。4.卵巢上皮癌组织中Evil蛋白和mRNA的异常表达与患者年龄、病理类型之间的差异无统计学意义(P>0.05),但其表达与临床分期、组织分化、有无淋巴结转移相关(P<0.05)。临床分期越晚、组织分化越差和伴随淋巴结远处转移,卵巢癌组织Evil蛋白的异常表达就越明显。小结:1、与正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织相比,Evil蛋白和mRNA在上皮性卵巢癌组织中高表达,其主要表达于在胞核上。2、与正常卵巢上皮细胞HOSEpiC相比,Evil蛋白在卵巢癌细胞内呈现高表达。3、上皮性卵巢癌患者中Evil蛋白的表达与临床分期、组织分化及是否存在淋巴结转移相关,临床分期越晚、组织分化越差和伴随淋巴结远处转移,卵巢癌组织Evil蛋白的异常表达就越明显。第二部分:抑制Evil表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响及其分子机制的初步探讨目的:探讨抑制Evil表达对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移及血管生成能力的影响,初步探讨Evil参与卵巢癌细胞生物学行为的分子机制。方法:1.应用GV159慢病毒载体,在OVCAR3、SKOV3细胞中构建干扰Evil表达的稳定细胞株,荧光定量PCR方法验证稳定细胞株是否构建成功。2.运用CCK-8增殖实验检测干扰Evil表达后对卵巢癌细胞增殖能力的影响。3.运用平板克隆形成实验检测干扰Evil后表达对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响;4.采用Western blot实验检测与增殖相关的调控因子cyclin Dl,CDK4的变化情况;5.运用Transwell小室迁移实验检测干扰Evil表达后对卵巢癌细胞迁移能力的影响;6.运用Matrigel胶侵袭实验检测干扰Evil表达后对卵巢癌细胞侵袭能力的影响;7.运用小管形成实验检测干扰Evil表达后对卵巢癌细胞新生血管形成能力的影响;8.采用Western blot实验检测与卵巢癌细胞的侵袭相关因子AKT、GSK3 β、Snail的变化9.运用Annexin-V/PI流式细胞仪检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞凋亡能力的影响;采用Western blot实验检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞的相关凋亡蛋白的影响10.建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型,检测干扰Evil表达后对裸鼠移植瘤增殖的影响;运用免疫组织化学方法检测移植瘤组织中MVD密度情况,分析体内调控Evil表达对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响。结果:1.为进一步研究Evil对卵巢癌细胞系生物学行为的影响,根据Evil在卵巢癌细胞系中的表达水平,我们用Evil呈现高表达的OVCAR3、SKOV3细胞构建干扰Evil表达慢病毒的稳定细胞株。表达载体以绿色荧光蛋白EGFP作为标记,应用实时荧光定量PCR方法验证稳定株是否构建成功。实验结果显示,OVCAR3细胞中,与转染空质粒载体的对照组细胞(OVCAR3-anti-NC)细胞相比较,转染干扰Evil表达慢病毒质粒载体的实验组细胞(OVCAR3-anti-Evil)中Evil mRNA水平显著下调,差异有统计学意义;SKOV3细胞中,与转染空质粒载体的对照组细胞(SKOV3-anti-NC)细胞相比较,转染干扰Evil表达慢病毒质粒载体的实验组细胞(SKOV3-anti-Evil)中Evil mRNA水平显著下调,差异有统计学意义。本研究结果显示,干扰Evil表达卵巢癌稳定细胞株构建成功。2.我们采用CCK-8法检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞增殖能力的影响。在SKOV3、OVCAR3细胞干扰Evil表达并设置空白对照Blank组和阴性对照NC组,在转染后1d,2d,3d,4d,5d和6d测定细胞生存活力。CCK-8增殖实验结果显示,转染anti-Evil的细胞在2天开始增殖活性显著低于空白Blank组细胞和阴性NC转染细胞(p<0.01),3d,4d,5d和6d其活性降低程度更为显著(p<0.001)。3.采用平板克隆形成实验检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。平板克隆形成实验结果显示,与OVCAR3-Blank组相比,OVCAR3-anti-NC组细胞的克隆形成能力无统计学差异(141.37±2.449%vs 135.19±1.539%,P 0.05);与 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC 组对照细胞相比较,干扰 Evil表达慢病毒后,OVCAR3-anti-Evil组细胞的克隆形成能力(32.41±1.579%)显著抑制,差异有统计学意义(P<0.001)。与SKOV3-Blank组相比,SKOV3-anti-NC组细胞的克隆形成能力无统计学差异(126.45±1.454%vs 117.09±2.872%,P>0.05);与SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC组对照细胞相比较,干扰Evil表达慢病毒后,SKOV3-anti-Evil组细胞的克隆形成能力(49.21±2.953%)显著抑制,差异有统计学意义(P<0.001)。4.采用Western blot实验检测与增殖相关的调控因子cyclin Dl,CDK4的变化情况。结果发现:在OVCAR3和SKOV3细胞株中,敲除Evil表达之后,降低了磷酸化AKT即P-AKT的表达,同时降低了 cyclinD1和CDK4蛋白的表达水平。5.采用Transwell小室迁移实验检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞迁移能力的影响;采用Matrigel胶侵袭实验检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞侵袭能力的影响。Transwell小室迁移实验结果显示,无血清培养24小时后OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil、SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil组细胞由上室面穿出至下室面的细胞数分别为84.25±0.164、81.91±0.334、20.43±0.413、86.95±0.381、81.24±0.328、35.53±0.129。与 OVCAR3-anti-NC组细胞相比较,干扰Evil表达的OVCAR3-anti-Evil组细胞迁移能力显著降低,差异有统计学意义(P=0.016)；与SKOV3-anti-NC组细胞相比较,干扰Evil表达的SKOV3-anti-Evil组细胞迁移能力显著降低,差异有统计学意义(P=0.0015)。6.Matrigel胶侵袭实验结果显示,无血清培养48小时后OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil、SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil组细胞由上室面穿出至下室面的细胞数分别为76.23±0.436、73.36±0.131、23.41 ±0.428、89.04±0.549、84.49±0.249、19.22±0.252,与 OVCAR3-anti-NC组细胞相比较,干扰Evil表达的OVCAR3-anti-Evil组细胞侵袭能力显著降低,差异有统计学意义(P=0.013)。与SKOV3-anti-NC组细胞相比较,SKOV3-anti-Evil组细胞的侵袭能力显著降低,差异有统计学意义(P=0.00018)。7.Evil通过AKT/GSK3β/Snail促进卵巢癌细胞的侵袭。上述实验已验证,Evil可以提高p-AKT蛋白的水平,进而促进AKT的活化。此次Westernblot实验证实:在OVCAR3和SKOV3细胞株中,敲除Evil表达之后,p-AKT蛋白的水平下降,p-AKT下游的的p-GSK3β表达也下降,而总的GSK3β则无明显变化。同时,Smail蛋白的表达水平也出现了下调,与EMT相关的E-cadherin蛋白表达水平升高,Vimentin蛋白表达下降。8.我们采用小管形成实验检测干扰Evil表达对卵巢癌细胞新生血管形成能力的影响。收集 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil、SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil 组细胞的培养上清,消化 HUVEC 细胞后,各实验组细胞培养上清重悬HUVEC细胞,培养24小时后观察HUVEC细胞小管管腔形成情况。实验结果显示,无论是在OVCAR3细胞还是SKOV3细胞里,Blank组与anti-NC组HUVEC细胞的小管管腔形成能力相比,两组之间无统计学差异(P>0.05);与 OVCAR3-Blank(40.86±0.261)、OVCAR3-anti-NC(38.57±0.250)组相比较,干扰 Evil 表达的 OVCAR3-anti-Evil(20.73±0.230)组HUVEC细胞的小管管腔形成能力显著抑制,差异有统计学意义(P<0.05);与 SKOV3-Blank(32.02±0.251)、SKOV3-anti-NC(29.12±0.460)组相比较,干扰Evil表达的SKOV3-anti-Evil(13.27±0.158)组HUVEC细胞小管管腔形成能力受到抑制更为显著,两组间相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。9.AnnexinV/PI 染色法实验结果显示,OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil 组细胞的凋亡率分别为(6.18±0.022)%、(6.32±0.035)%和(15.59±0.048)%,OVCAR3-Blank 和 OVCAR3-anti-NC 组细胞相比较,细胞的凋亡率无明显差异(P>0.05)。干扰Evil表达OVCAR3-anti-Evil组细胞的凋亡率与其两组对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil 组细胞的凋亡率分别为(7.08±0.041)%、(7.30±0.055)%和(15.58±0.068)%,SKOV3-Blank 和 SKOV3-anti-NC 组细胞相比较细胞的凋亡率无明显差异(P>0.05)。干扰Evil表达SKOV3-anti-Evil组细胞的凋亡率与其两组对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot实验证实:在OVCAR3和SKOV3细胞株中,敲除Evil表达之后,Bc12蛋白表达下调,cleaved-Caspas3蛋白表达上调。提示下调Evil表达促进了卵巢癌细胞的凋亡。本实验结果进一步说明Evil抑制肿瘤细胞的凋亡,进而诱导卵巢癌细胞的增殖能力。10.我们采用BALB/C-nu雌性裸鼠建立卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤实验模型,进行干扰Evil表达对卵巢癌增殖、侵袭影响的体内实验研究。裸鼠皮下移植瘤实验结果显示,干扰Evil表达的OVCAR3-anti-Evil组裸鼠的肿瘤体积显著小于OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC两个对照组的裸鼠,随饲养天数增加,裸鼠移植瘤体积差异逐渐增大,实验组分别与两个对照组进行组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。裸鼠移植瘤组织免疫组化检测肿瘤微血管密度,结果显示,裸鼠移植瘤组织中CD34内皮细胞标记染色呈棕黄色,定位于血管内皮细胞的胞膜,与OVCAR3-anti-NC组裸鼠相比较,干扰Evil表达OVCAR3-anti-Evil组裸鼠肿瘤组织中MVD平均值显著降低,两组间相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。本研究体内实验结果显示,干扰Evil表达可减少肿瘤组织血管生成,促进组织凋亡坏死发生,抑制肿瘤的增殖和侵袭。小结:1.体外及体内实验证实干扰Evil表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭及转移,促进细胞的凋亡。2.Evil在卵巢癌细胞中的生物学效应可能是通过对PI3K-AKT信号通路的活化来实现的。第三部分:抑制Evil表达对卵巢癌细胞化疗药物敏感性的影响目的:探讨干扰Evil表达对卵巢癌化疗药物敏感性有无影响及其对耐药机制的初步探讨。方法:1.应用GV159慢病毒载体,在OVCAR3、SKOV3细胞中构建干扰Evil表达的稳定细胞株2.通过 CCK-8 法检测 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil 三组细胞株及 SKOV3-Blank、SKOV3-ainti-NC、SKOV3-anti-Evil 三组细胞株生长抑制率并计算IC50。3.软琼脂培养克隆试验检测干扰Evil表达后卵巢癌细胞在DDP中的克隆抑制率。4.利用Western blot检测Evil表达下调后不同细胞株多药耐药蛋白P-gp和MRP1的表达变化。5.利用Western blot检测抑制Evil表达后不同细胞株DNA损伤修复酶MGMT、MMR的改变。结果:1.通过CCK-8法检测肿瘤细胞株生长抑制率并计算IC50,我们发现在OVCAR3和SKOV3细胞株单独使用DDP的耐药指数是28.73±0.75μg/ml和27.92±1.07μg/ml,同时OVCAR3和SKOV3空载体组与DDP联合作用的耐药指数分别是 27.49±0.52μg/ml 和 26.32±0.63μg/ml,然而 OVCAR3 和 SKOV3 细胞的干扰Evil表达组与DDP联合作用的耐药指数分别是13.67±1.08μg/ml和15.86±1.31μg/ml,这表明在卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3中抑制Evil表达之后,卵巢癌细胞对DDP的敏感性明显升高,耐药性明显降低(P<0.05)。2.分别取生长状态尚可的 OVCAR3-Blank、OVCAR3-anti-NC、OVCAR3-anti-Evil 三组细胞株及 SKOV3-Blank、SKOV3-anti-NC、SKOV3-anti-Evil 三组细胞株培养克隆。实验结果如图所示,与Blank对照组及NC空白组相比,Evil干扰组的SKOV3和OVCAR3细胞在DDP中的克隆抑制率明显增高(P<0.05),说明干扰Evil表达加上DDP可以明显降低卵巢癌细胞的克隆能力,进一步证实了 Evil表达下调的卵巢癌细胞对DDP药物敏感性显著增高。3.为进一步探讨Evil表达对卵巢癌细胞耐药性影响的机制,我们利用Western blot检测Evil表达下调后不同细胞株多药耐药蛋白P-gp和MRP1的表达变化。结果如图所示,我们发现抑制Evil后,SKOV3和OVCAR3细胞株中P-gp和MRP1的表达明显下降(P<0.05),由此我们考虑Evil可能是通过调节多药耐药蛋白来影响卵巢癌顺铂耐药性的。4.上一步实验发现Evil表达对卵巢癌细胞DDP敏感性的影响并不是通过多药耐药蛋白来调控的,在这部分我们继续用Western blot检测抑制Evil表达后不同细胞株DNA损伤修复酶MGMT、MMR的改变,以探求可能调控的另外一种机制。结果如图所示,我们发现Evil表达下调后,SKOV3和OVCAR3细胞株中MGMT、MMR的蛋白均显著下降,我们推测Evil可能是通过影响DNA损伤修复酶的变化来调节卵巢癌细胞DDP耐药性。小结:1.干扰Evil表达可以提高卵巢癌细胞对DDP的敏感性。2.Evil可能是通过多药耐药蛋白及DNA损伤修复酶的作用机制来影响卵巢癌细胞化疗药物敏感性。结论:1.Evil异常表达与卵巢癌发生发展关系密切,可能参与了卵巢癌的恶性转化;2.Evil可能通过对PI3K-AKT信号通路的活化进而促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移,抑制细胞的凋亡；3.Evil可能在多药耐药蛋白及DNA损伤修复酶共同作用下参与了卵巢癌细胞化疗耐药,干扰Evil表达可有效逆转卵巢癌顺铂耐药;4.Evil基因有作为卵巢癌基因治疗靶点的潜在价值。