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卒中已经成为一个主要的公共健康问题。有效的治疗方法的缺失增加了对新的治疗靶点的需要。哺乳动物大脑具有自我修复的能力，从而重新获取丢失的功能。因此，促进再生修复为卒中提供了一个新的治疗方法，包括神经发生、树突重构和轴突芽生等。实验研究发现神经元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)和突触后密度蛋白-95(protein postsynaptic density-95, PSD-95)之间的相互作用负性调控大鼠卒中后再生修复。而神经元中nNOS-PSD-95解耦联则促进神经干细胞(neural stem cells, NSCs)向神经元分化，并促进新生细胞向缺血损伤区迁移，同时增强卒中后新生神经元轴突生长和成熟神经元树突棘形成。更有趣的是，nNOS-PSD-95解耦联能够通过促进大鼠脑内再生修复从而在恢复阶段改善卒中后运动功能。由此，nNOS-PSD-95解耦联对脑缺血后神经发生的促进作用已经明确，但隐藏在其中的机制仍不清楚。
根据文献报道，表观遗传学能够调控NSCs的分化命运。而组蛋白乙酰化和去乙酰化是表观遗传学机制中的重要内容，分别通过组蛋白酰基转移酶(histone acetyltransfeases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)来参与基因的激活和抑制；并且组蛋白去乙酰化酶-2(histone deacetylase -2, HDAC2)选择性表达在神经细胞谱系，在成年后神经发生以及NSCs分化过程中发挥着重要作用。由此，我们猜测：在nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生过程中，HDAC2可能发挥着至关重要的作用。此外，神经源性分化蛋白(neurogenic differentiation, NeuroD )是神经元特异性的转录因子；而在NSCs中，HDACs能够沉默关键神经发生转录因子的表达，例如NeuroD。因此，在HDAC2调控神经发生过程中，NeuroD可能是HDAC2下游的关键效应分子。
实验室早期研究发现，在脑缺血梗死周围区，Best1表达明显上调；而抑制HDACs能够下调脑缺血后Best1的高表达，即表观遗传学正性调控脑缺血后Best1表达。因此，我们猜测：在nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2表达促进功能恢复过程中，Best1可能发挥着重要作用。
综上，本论文研究了nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生的表观遗传学机制：第一章，使用大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO )模型，以及神经干细胞或是神经干细胞和神经元共培养的氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)模型，结合体内体外实验，研究nNOS-PSD-95解耦联是否通过影响HDAC2促进脑缺血后NSCs向神经元分化。第二章，进一步探究在nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生过程中，HDAC2的下游机制是否与组蛋白乙酰化介导的神经元分化关键转录因子NeuroD的表达增加相关。第三章，使用小鼠光照缺血模型，以及星形胶质细胞的OGD模型，结合体内体外实验，探索脑缺血后干扰Best1表达对运动功能的影响及其机制。
第一章为了探究脑缺血后神经元中nNOS-PSD-95解耦联是如何发挥对NSCs向神经元分化的促进作用，首先，我们将研究重点放在了HDAC2上。为了特异性地调控HDAC2，我们设计了包含HDAC2shRNA的慢病毒(LV-HDAC2-shRNA)，以及选择性表达HDAC2的腺病毒(Ad-HDAC2)。实验结果显示LV-HDAC2-shRNA感染的NSCs向神经元分化的能力提高，而Ad-HDAC2感染的NSCs则恰恰相反。大鼠齿状回(dentate gyrus, DG)微量注射Ad-HDAC2使得BrdU+/DCX+细胞数明显减少。由此可知，HDAC2负性调控NSCs向神经元分化。
脑缺血引起nNOS-PSD-95相互作用增加，激活nNOS，从而使神经元释放的NO增加；那么，NO在nNOS-PSD-95耦联负性调控神经发生过程中又扮演了怎样的角色呢？首先，我们在NSCs和神经元共培养的OGD模型中使用NO供体和清除剂，证明了NO对NSCs分化也存在负性调节作用。因此，我们猜想神经元诱导产生的NO是不是通过调节HDAC2来影响NSCs的分化命运？我们使用NO供体来模拟神经元释放的NO，发现NSCs中HDAC2的亚硝基化水平未改变，但HDAC2的蛋白表达和酶活性明显上调，NO清除剂得到了相反的结果，即外源NO确实能上调NSCs中HDAC2的表达。接着我们分别在NSCs和神经元共培养的OGD模型中以及NSCs单独培养的OGD模型中，检测NSCs中HDAC2的蛋白水平和酶活性。我们发现只有在NSCs和神经元共培养的OGD模型中，NSCs中HDAC2的蛋白水平和酶活性才会上调，且能被NO清除剂逆转。由此可知，OGD后神经元诱导产生的NO上调NSCs中HDAC2的表达和活性。也就是说，在脑缺血发生后，若解除nNOS-PSD-95耦联，就能使神经元释放的NO减少，从而对NSCs中的HDAC2产生抑制作用。
随后，我们使用LV-HDAC2-shRNA感染NSCs，接着将其和神经元共培养，并进行OGD操作。结果表明，OGD导致β-Ⅲ-tubulin+新生细胞和多突起新生神经元减少，NSCs中HDAC2的敲减能逆转这些结果。提示在脑缺血后，上调的HDAC2阻碍了NSCs向神经元的分化，抑制HDAC2的上调则有利于脑缺血后的神经修复。
那么nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生的效应是否依赖于对HDAC2的抑制呢？我们在NSCs过表达HDAC2的共培养体系中给予ZL006解除OGD加剧的神经元nNOS-PSD-95耦联，观察NSCs向神经元分化的情况。实验研究发现，ZL006逆转OGD导致的神经元分化减少和突起生长损伤，而HDAC2过表达则取消了ZL006的作用。综上，nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2促进脑缺血后NSCs向神经元分化。
第二章组蛋白乙酰化对神经发生至关重要，并且NeuroD是神经元特异性的转录因子。因此，为了阐明脑缺血后nNOS-PSD-95耦联通过HDAC2阻碍NSCs向神经元分化的下游机制，我们重点关注NeuroD。首先，我们使用NO供体处理NSCs，发现乙酰化组蛋白H4(acetylated histone H4, acety-H4)和NeuroD表达水平明显降低，而NO清除剂能够逆转NO供体的这种作用。同时，HDAC2抑制剂TSA和LV-HDAC2-shRNA带来的HDAC2的敲减也可以抵消NO供体对组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达的下调，即NO通过上调HDAC2来抑制组蛋白乙酰化，从而沉默NSCs中NeuroD表达。
为了确证上述实验结果，我们在NSCs敲减HDAC2的共培养体系中进行OGD操作，检测组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达。如我们所料，OGD使得NSCs中组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达降低。同样地，HDAC2的敲减逆转了OGD带来的效应。也就是说，nNOS-PSD-95解耦联能通过抑制HDAC2来升高组蛋白乙酰化水平，从而促进NSCs中NeuroD表达。
综上所述，我们得到结论：在脑缺血发生后，解除nNOS-PSD-95耦联，能够减少神经元来源的NO，抑制其上调NSCs中HDAC2表达和活性的作用，从而升高组蛋白乙酰化水平，实现对神经元分化关键转录因子NeuroD的表观遗传学调控，促进神经发生。
第三章在nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2表达促进功能恢复过程中，Best1是否发挥着重要作用？为了解决该问题，在本章节，我们重点研究Best1对脑缺血后运动功能的影响。
首先，我们发现在脑缺血后第7d、10d，梗死周围区Best1表达明显增加。为了特异性敲减Best1，我们构建了重组腺病毒AAV-Best1-shRNA-GFP，发现干扰Best1表达有利于脑缺血后运动功能改善。Best1的W93C突变会抑制其离子通道功能，因此我们设计了过表达突变病毒AAV-Best1W93C-3flag-GFP，实验结果显示抑制Best1的离子通道功能有利于脑缺血后运动功能恢复。
脑缺血梗死周围区星形胶质细胞会大量激活，其激活的主要标志之一是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达增加，因此我们检测了脑缺血梗死周围区GFAP的表达时程。实验结果显示GFAP在脑缺血后第3d、7d、10d持续高表达，并且在造模后第10d，梗死周围区Best1和GFAP共标量明显增加，提示我们星形胶质细胞中的Best1可能在脑缺血延迟期功能恢复过程中发挥了重要作用。因此，我们体外培养星形胶质细胞，进行OGD操作，发现GFAP和Best1在造模后48、72h高表达。接着，我们又发现干扰Best1表达能够抑制GFAP表达，即抑制星形胶质细胞激活。
白乙酰化，从而沉默NSCs中NeuroD表达。
为了确证上述实验结果，我们在NSCs敲减HDAC2的共培养体系中进行OGD操作，检测组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达。如我们所料，OGD使得NSCs中组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达降低。同样地，HDAC2的敲减逆转了OGD带来的效应。也就是说，nNOS-PSD-95解耦联能通过抑制HDAC2来升高组蛋白乙酰化水平，从而促进NSCs中NeuroD表达。
综上所述，我们得到结论：在脑缺血发生后，解除nNOS-PSD-95耦联，能够减少神经元来源的NO，抑制其上调NSCs中HDAC2表达和活性的作用，从而升高组蛋白乙酰化水平，实现对神经元分化关键转录因子NeuroD的表观遗传学调控，促进神经发生。
第三章在nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2表达促进功能恢复过程中，Best1是否发挥着重要作用？为了解决该问题，在本章节，我们重点研究Best1对脑缺血后运动功能的影响。
首先，我们发现在脑缺血后第7d、10d，梗死周围区Best1表达明显增加。为了特异性敲减Best1，我们构建了重组腺病毒AAV-Best1-shRNA-GFP，发现干扰Best1表达有利于脑缺血后运动功能改善。Best1的W93C突变会抑制其离子通道功能，因此我们设计了过表达突变病毒AAV-Best1W93C-3flag-GFP，实验结果显示抑制Best1的离子通道功能有利于脑缺血后运动功能恢复。
脑缺血梗死周围区星形胶质细胞会大量激活，其激活的主要标志之一是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达增加，因此我们检测了脑缺血梗死周围区GFAP的表达时程。实验结果显示GFAP在脑缺血后第3d、7d、10d持续高表达，并且在造模后第10d，梗死周围区Best1和GFAP共标量明显增加，提示我们星形胶质细胞中的Best1可能在脑缺血延迟期功能恢复过程中发挥了重要作用。因此，我们体外培养星形胶质细胞，进行OGD操作，发现GFAP和Best1在造模后48、72h高表达。接着，我们又发现干扰Best1表达能够抑制GFAP表达，即抑制星形胶质细胞激活。
文献报道，激活的星形胶质细胞重新分配的Best1能够介导tonicγ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)释放，而减小卒中后GABA介导的tonic有利于功能恢复。再结合上述实验结果，我们猜想：脑缺血后干扰Best1表达，可能是通过抑制星形胶质细胞激活，从而抑制其中Best1表达以及离子通道功能，减少GABA释放，最终改善脑缺血后运动功能。文献报道，蛋白酶激活受体-1(protease-activated receptor 1, PAR1)的激活能够促进星形胶质细胞中Best1释放谷氨酸以及GABA等胶质递质；而单胺氧化酶B(monoamine oxidase B, MAOB)介导了星形胶质细胞中tonicGABA的合成。因此，在本章中，我们检测了脑缺血梗死周围区PAR1和MAOB的表达时程，结果显示MAOB在造模后第3d、7d、10d持续高表达，而PAR1只在造模后第7d高表达，说明脑缺血后梗死周围区星形胶质细胞合成的GABA增加，且Best1释放GABA能力增强，初步验证了我们的猜想。
根据文献报道，表观遗传学能够调控NSCs的分化命运。而组蛋白乙酰化和去乙酰化是表观遗传学机制中的重要内容，分别通过组蛋白酰基转移酶(histone acetyltransfeases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)来参与基因的激活和抑制；并且组蛋白去乙酰化酶-2(histone deacetylase -2, HDAC2)选择性表达在神经细胞谱系，在成年后神经发生以及NSCs分化过程中发挥着重要作用。由此，我们猜测：在nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生过程中，HDAC2可能发挥着至关重要的作用。此外，神经源性分化蛋白(neurogenic differentiation, NeuroD )是神经元特异性的转录因子；而在NSCs中，HDACs能够沉默关键神经发生转录因子的表达，例如NeuroD。因此，在HDAC2调控神经发生过程中，NeuroD可能是HDAC2下游的关键效应分子。
实验室早期研究发现，在脑缺血梗死周围区，Best1表达明显上调；而抑制HDACs能够下调脑缺血后Best1的高表达，即表观遗传学正性调控脑缺血后Best1表达。因此，我们猜测：在nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2表达促进功能恢复过程中，Best1可能发挥着重要作用。
综上，本论文研究了nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生的表观遗传学机制：第一章，使用大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO )模型，以及神经干细胞或是神经干细胞和神经元共培养的氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)模型，结合体内体外实验，研究nNOS-PSD-95解耦联是否通过影响HDAC2促进脑缺血后NSCs向神经元分化。第二章，进一步探究在nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生过程中，HDAC2的下游机制是否与组蛋白乙酰化介导的神经元分化关键转录因子NeuroD的表达增加相关。第三章，使用小鼠光照缺血模型，以及星形胶质细胞的OGD模型，结合体内体外实验，探索脑缺血后干扰Best1表达对运动功能的影响及其机制。
第一章为了探究脑缺血后神经元中nNOS-PSD-95解耦联是如何发挥对NSCs向神经元分化的促进作用，首先，我们将研究重点放在了HDAC2上。为了特异性地调控HDAC2，我们设计了包含HDAC2shRNA的慢病毒(LV-HDAC2-shRNA)，以及选择性表达HDAC2的腺病毒(Ad-HDAC2)。实验结果显示LV-HDAC2-shRNA感染的NSCs向神经元分化的能力提高，而Ad-HDAC2感染的NSCs则恰恰相反。大鼠齿状回(dentate gyrus, DG)微量注射Ad-HDAC2使得BrdU+/DCX+细胞数明显减少。由此可知，HDAC2负性调控NSCs向神经元分化。
脑缺血引起nNOS-PSD-95相互作用增加，激活nNOS，从而使神经元释放的NO增加；那么，NO在nNOS-PSD-95耦联负性调控神经发生过程中又扮演了怎样的角色呢？首先，我们在NSCs和神经元共培养的OGD模型中使用NO供体和清除剂，证明了NO对NSCs分化也存在负性调节作用。因此，我们猜想神经元诱导产生的NO是不是通过调节HDAC2来影响NSCs的分化命运？我们使用NO供体来模拟神经元释放的NO，发现NSCs中HDAC2的亚硝基化水平未改变，但HDAC2的蛋白表达和酶活性明显上调，NO清除剂得到了相反的结果，即外源NO确实能上调NSCs中HDAC2的表达。接着我们分别在NSCs和神经元共培养的OGD模型中以及NSCs单独培养的OGD模型中，检测NSCs中HDAC2的蛋白水平和酶活性。我们发现只有在NSCs和神经元共培养的OGD模型中，NSCs中HDAC2的蛋白水平和酶活性才会上调，且能被NO清除剂逆转。由此可知，OGD后神经元诱导产生的NO上调NSCs中HDAC2的表达和活性。也就是说，在脑缺血发生后，若解除nNOS-PSD-95耦联，就能使神经元释放的NO减少，从而对NSCs中的HDAC2产生抑制作用。
随后，我们使用LV-HDAC2-shRNA感染NSCs，接着将其和神经元共培养，并进行OGD操作。结果表明，OGD导致β-Ⅲ-tubulin+新生细胞和多突起新生神经元减少，NSCs中HDAC2的敲减能逆转这些结果。提示在脑缺血后，上调的HDAC2阻碍了NSCs向神经元的分化，抑制HDAC2的上调则有利于脑缺血后的神经修复。
那么nNOS-PSD-95解耦联促进脑缺血后神经发生的效应是否依赖于对HDAC2的抑制呢？我们在NSCs过表达HDAC2的共培养体系中给予ZL006解除OGD加剧的神经元nNOS-PSD-95耦联，观察NSCs向神经元分化的情况。实验研究发现，ZL006逆转OGD导致的神经元分化减少和突起生长损伤，而HDAC2过表达则取消了ZL006的作用。综上，nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2促进脑缺血后NSCs向神经元分化。
第二章组蛋白乙酰化对神经发生至关重要，并且NeuroD是神经元特异性的转录因子。因此，为了阐明脑缺血后nNOS-PSD-95耦联通过HDAC2阻碍NSCs向神经元分化的下游机制，我们重点关注NeuroD。首先，我们使用NO供体处理NSCs，发现乙酰化组蛋白H4(acetylated histone H4, acety-H4)和NeuroD表达水平明显降低，而NO清除剂能够逆转NO供体的这种作用。同时，HDAC2抑制剂TSA和LV-HDAC2-shRNA带来的HDAC2的敲减也可以抵消NO供体对组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达的下调，即NO通过上调HDAC2来抑制组蛋白乙酰化，从而沉默NSCs中NeuroD表达。
为了确证上述实验结果，我们在NSCs敲减HDAC2的共培养体系中进行OGD操作，检测组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达。如我们所料，OGD使得NSCs中组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达降低。同样地，HDAC2的敲减逆转了OGD带来的效应。也就是说，nNOS-PSD-95解耦联能通过抑制HDAC2来升高组蛋白乙酰化水平，从而促进NSCs中NeuroD表达。
综上所述，我们得到结论：在脑缺血发生后，解除nNOS-PSD-95耦联，能够减少神经元来源的NO，抑制其上调NSCs中HDAC2表达和活性的作用，从而升高组蛋白乙酰化水平，实现对神经元分化关键转录因子NeuroD的表观遗传学调控，促进神经发生。
第三章在nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2表达促进功能恢复过程中，Best1是否发挥着重要作用？为了解决该问题，在本章节，我们重点研究Best1对脑缺血后运动功能的影响。
首先，我们发现在脑缺血后第7d、10d，梗死周围区Best1表达明显增加。为了特异性敲减Best1，我们构建了重组腺病毒AAV-Best1-shRNA-GFP，发现干扰Best1表达有利于脑缺血后运动功能改善。Best1的W93C突变会抑制其离子通道功能，因此我们设计了过表达突变病毒AAV-Best1W93C-3flag-GFP，实验结果显示抑制Best1的离子通道功能有利于脑缺血后运动功能恢复。
脑缺血梗死周围区星形胶质细胞会大量激活，其激活的主要标志之一是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达增加，因此我们检测了脑缺血梗死周围区GFAP的表达时程。实验结果显示GFAP在脑缺血后第3d、7d、10d持续高表达，并且在造模后第10d，梗死周围区Best1和GFAP共标量明显增加，提示我们星形胶质细胞中的Best1可能在脑缺血延迟期功能恢复过程中发挥了重要作用。因此，我们体外培养星形胶质细胞，进行OGD操作，发现GFAP和Best1在造模后48、72h高表达。接着，我们又发现干扰Best1表达能够抑制GFAP表达，即抑制星形胶质细胞激活。
白乙酰化，从而沉默NSCs中NeuroD表达。
为了确证上述实验结果，我们在NSCs敲减HDAC2的共培养体系中进行OGD操作，检测组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达。如我们所料，OGD使得NSCs中组蛋白乙酰化水平和NeuroD表达降低。同样地，HDAC2的敲减逆转了OGD带来的效应。也就是说，nNOS-PSD-95解耦联能通过抑制HDAC2来升高组蛋白乙酰化水平，从而促进NSCs中NeuroD表达。
综上所述，我们得到结论：在脑缺血发生后，解除nNOS-PSD-95耦联，能够减少神经元来源的NO，抑制其上调NSCs中HDAC2表达和活性的作用，从而升高组蛋白乙酰化水平，实现对神经元分化关键转录因子NeuroD的表观遗传学调控，促进神经发生。
第三章在nNOS-PSD-95解耦联通过抑制HDAC2表达促进功能恢复过程中，Best1是否发挥着重要作用？为了解决该问题，在本章节，我们重点研究Best1对脑缺血后运动功能的影响。
首先，我们发现在脑缺血后第7d、10d，梗死周围区Best1表达明显增加。为了特异性敲减Best1，我们构建了重组腺病毒AAV-Best1-shRNA-GFP，发现干扰Best1表达有利于脑缺血后运动功能改善。Best1的W93C突变会抑制其离子通道功能，因此我们设计了过表达突变病毒AAV-Best1W93C-3flag-GFP，实验结果显示抑制Best1的离子通道功能有利于脑缺血后运动功能恢复。
脑缺血梗死周围区星形胶质细胞会大量激活，其激活的主要标志之一是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达增加，因此我们检测了脑缺血梗死周围区GFAP的表达时程。实验结果显示GFAP在脑缺血后第3d、7d、10d持续高表达，并且在造模后第10d，梗死周围区Best1和GFAP共标量明显增加，提示我们星形胶质细胞中的Best1可能在脑缺血延迟期功能恢复过程中发挥了重要作用。因此，我们体外培养星形胶质细胞，进行OGD操作，发现GFAP和Best1在造模后48、72h高表达。接着，我们又发现干扰Best1表达能够抑制GFAP表达，即抑制星形胶质细胞激活。
文献报道，激活的星形胶质细胞重新分配的Best1能够介导tonicγ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)释放，而减小卒中后GABA介导的tonic有利于功能恢复。再结合上述实验结果，我们猜想：脑缺血后干扰Best1表达，可能是通过抑制星形胶质细胞激活，从而抑制其中Best1表达以及离子通道功能，减少GABA释放，最终改善脑缺血后运动功能。文献报道，蛋白酶激活受体-1(protease-activated receptor 1, PAR1)的激活能够促进星形胶质细胞中Best1释放谷氨酸以及GABA等胶质递质；而单胺氧化酶B(monoamine oxidase B, MAOB)介导了星形胶质细胞中tonicGABA的合成。因此，在本章中，我们检测了脑缺血梗死周围区PAR1和MAOB的表达时程，结果显示MAOB在造模后第3d、7d、10d持续高表达，而PAR1只在造模后第7d高表达，说明脑缺血后梗死周围区星形胶质细胞合成的GABA增加，且Best1释放GABA能力增强，初步验证了我们的猜想。