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乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁到女性健康。随着诊疗技术的日益完善，乳腺癌患者的生存率已得到显著提升，但由于乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSCs）的存在使得部分缓解期的患者出现复发和转移，成为致死的主要原因。因此，靶向BCSCs的治疗策略是有效治疗乳腺癌的关键。近年来的研究结果表明，微小RNA-7（microRNA-7，miR-7）在多种肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用。本课题组前期发现，过表达miR-7可以显著下调BCSCs亚群比例，但具体机制未明。由于BCSCs亚群的多寡与乳腺癌患者的治疗和预后密切相关，若能阐明miR-7下调BCSCs亚群的调节机制，有望为靶向调控BCSCs寻求到新靶点，从而为有效治疗乳腺癌提供新途径。
本研究通过生物信息学预测和蛋白芯片检测等手段发现，miR-7同CD44、ESAM及RELA三个分子间可能存有潜在调控关系。研究显示，CD44是存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，在多种肿瘤中高表达，与肿瘤细胞的浸润转移相关，同时也是 BCSCs 的表面标志物之一。内皮细胞选择性黏附分子（ endothelial cell-selective adhesion molecule，ESAM）被鉴定为一种新的造血干细胞标志物，且能通过调节肿瘤的血管生成来促进黑色素瘤和肺癌细胞的转移。此外，RELA作为核转录因子 NF-κB 的家族成员之一，在受到细胞内外因素的刺激后活化并转移至细胞核内，进而诱导肿瘤相关基因的表达。目前，在乳腺癌及BCSCs中，关于miR-7对这些分子的具体调控机制尚未有明确报道。
基于以上研究背景，本研究将关注miR-7与CD44、ESAM及RELA之间的分子调控作用，以期阐明miR-7影响BCSCs亚群的机制，为靶向BCSCs根治乳腺癌提供新的策略。
研究目的
探讨miR-7下调BCSCs亚群比例及抑制BCSCs转移的分子机制，为靶向调控BCSCs治疗乳腺癌提供实验依据。
研究内容与方法
1. MiR-7对人乳腺癌细胞系中的BCSCs亚群及相关分子表达的影响：分别在四种人乳腺癌细胞系中转染miR-7 mimic、miR-7 inhibitor及其相应的对照，通过qPCR、FCM及WB检测各组细胞中BCSCs亚群的比例及相关分子表达水 平的变化。采用瘤内注射miR-7激动剂（miR-7 agomir）治疗BCSCs所致鼠原位瘤，取各组小鼠的肿瘤组织进行检测，进一步确认细胞系中的实验结果。
2. 确定miR-7的调节靶点，探究miR-7下调BCSCs亚群的分子机制：生物信息学手段预测miR-7的作用靶点，构建荧光报告质粒，采用双荧光素酶报告基因实验、ChIP-PCR实验及siRNA干扰实验对分子间的相互作用加以验证。
3. 乳腺癌临床标本中miR-7与相关分子表达关系的检测：收集乳腺癌临床标本及其配对的癌旁组织，提取组织总RNA和蛋白，通过qPCR和WB检测组织中各分子的表达。
4. 人乳腺癌原代细胞的分离培养与鉴定：采用组织块培养法从乳腺癌临床标本中分离并培养人乳腺癌原代细胞，通过qPCR、FCM及WB实验比较新建立的原代细胞与另外三株人乳腺癌细胞系中的 BCSCs 亚群比例及相关分子表达水平。
5. 过表达 miR-7 对 BCSCs 在 NOD/SCID 鼠体内致瘤性的影响：构建过表达miR-7的慢病毒重组体并感染人乳腺癌原代细胞，筛选稳定过表达miR-7的单克隆细胞株并扩大培养，qPCR、FCM及WB检测细胞中的分子表达水平。构建BCSCs所致鼠原位瘤，监测荷瘤鼠的一般状况及肿瘤生长情况，取各组荷瘤鼠的肿瘤、肺、脑等组织进行 qPCR、FCM、WB、IHC 及 IF 等实验检测。
6. 蛋白芯片技术检测BCSCs所致鼠肿瘤组织中的蛋白表达情况：抽提对照组和miR-7 agomir治疗组小鼠的肿瘤组织总蛋白进行蛋白芯片检测，分析实验数据，筛选出感兴趣的差异表达蛋白。
7. 探究miR-7抑制差异表达蛋白ESAM的分子机制：生物信息学手段预测靶点，通过ChIP-PCR、miRNA转染、siRNA干扰实验以及检测乳腺癌临床标本中相关分子表达的情况，验证miR-7对ESAM的调控作用。
8. MiR-7 调控 ESAM 对乳腺癌细胞及 BCSCs 生物学功能的影响：转染 miR-7 mimic和siESAM下调MDA-MB-231细胞中ESAM的表达水平，检测细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移能力的变化。过表达miR-7或下调ESAM治疗BCSCs所致鼠原位瘤，检测肿瘤组织中转移相关分子的改变。
研究结果
1. 在四株人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3及LD细胞中，体外转染miR-7 mimic能显著增加miR-7的表达量，同时有效降低BCSCs亚群比例，并抑制CD44、RELA、EGFR及HAS2等分子的表达；而通过转染miR-7 inhibitor抑制细胞中miR-7的表达量后，BCSCs亚群的比例上调，且以上相关分子的表达水平也增加。此外，相较对照组，miR-7 agomir治疗组肿瘤组织中的BCSCs亚群比例及CD44、RELA等分子的表达水平也受到明显抑制，与细胞系中的实验结果相一致。
2. 利用生物信息学手段预测出miR-7在RELA的3-UTR区有2个潜在靶位点，且RELA在CD44的启动子区存在7个结合位点。双荧光素酶报告基因实验的检测结果显示，在miR-7 mimic和含有RELA 3-UTR区全长的荧光报告质粒的共转染组中，海肾萤光素酶的信号强度显著低于其他各对照组，表明miR-7能靶向RELA的3-UTR区从而抑制RELA的表达。ChIP-PCR实验也证实了RELA可结合至CD44启动子区的-1234~-1243、-1654~-1663及-2073~-2082三个区域，即RELA能直接靶向调控CD44的转录表达。进一步在四株人乳腺癌细胞系中利用siRELA下调RELA后，细胞中CD44的表达水平与对照组相比出现不同程度的下降，证明RELA对CD44存在调控作用。
3. 临床标本的检测结果显示，相较癌旁组织，在乳腺癌患者的癌组织中 miR-7低表达而RELA和CD44高表达，且miR-7的表达水平与后两者间呈负相关，而RELA和CD44两者间的表达水平呈正相关。
4. 从临床乳腺癌手术标本中成功分离、培养并鉴定出一株人乳腺癌原代细胞系，命名为LD细胞。从LD、MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3四株细胞系的检测结果发现，相对高表达miR-7的MCF-7细胞，其RELA和CD44的表达水平及 BCSCs 的比例较低；而在另外三株 miR-7 表达量较低的细胞系中， RELA和CD44的表达水平及BCSCs比例则较高。
5. 在LD细胞中成功筛选出稳定过表达miR-7的单克隆细胞株并扩大培养。体外和体内实验结果显示，通过慢病毒系统过表达miR-7能有效降低LD细胞中RELA和CD44的表达水平，下调LD-CSCs比例并显著抑制其在NOD/SCID鼠体内的致瘤性和肺转移能力。
6. BCSCs所致鼠肿瘤的组织蛋白芯片检测结果显示，相较对照组，miR-7 agomir治疗组的肿瘤组织中有 34 个蛋白分子的表达量下调，21 个蛋白分子表达上调。其中ESAM蛋白的表达水平较对照组降低了3.2倍，qPCR检测结果与蛋白芯片结果近似，显示ESAM表达量下降了约3.6倍。
7. 生物信息学预测结果显示，在ESAM的启动子区存在4个RELA的结合位点。通过ChIP-PCR实验证实了RELA可结合至ESAM启动子区的-1232~ -1243区域，即RELA可直接调控ESAM的转录。MiR-7 mimic转染和siRELA干扰实验以及对乳腺癌临床标本中分子表达的检测结果，进一步验证了 miR-7和RELA对ESAM的调控作用。
8. MDA-MB-231细胞中转染miR-7 mimic或siESAM，均可有效下调ESAM的表达量，同时显著降低细胞的增殖、克隆形成及迁移能力。动物实验结果表明，相较对照组，在过表达miR-7组和ESAM下调组中，BCSCs所致鼠的肿瘤生长缓慢，肿瘤的血管生成及转移显著受到抑制。
结论
MiR-7能显著下调MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3及LD四株人乳腺癌细胞系中的BCSCs亚群，并有效抑制BCSCs在NOD/SCID小鼠体内的致瘤性及转移能力。分子机制研究显示，miR-7通过靶向RELA，间接抑制CD44和ESAM的分子表达，从而减低BCSCs的数量及其干性，抑制肿瘤转移。本研究结果提示，miR-7及RELA、CD44和ESAM可作为靶向BCSCs治疗乳腺癌的有效靶点。
本研究通过生物信息学预测和蛋白芯片检测等手段发现，miR-7同CD44、ESAM及RELA三个分子间可能存有潜在调控关系。研究显示，CD44是存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，在多种肿瘤中高表达，与肿瘤细胞的浸润转移相关，同时也是 BCSCs 的表面标志物之一。内皮细胞选择性黏附分子（ endothelial cell-selective adhesion molecule，ESAM）被鉴定为一种新的造血干细胞标志物，且能通过调节肿瘤的血管生成来促进黑色素瘤和肺癌细胞的转移。此外，RELA作为核转录因子 NF-κB 的家族成员之一，在受到细胞内外因素的刺激后活化并转移至细胞核内，进而诱导肿瘤相关基因的表达。目前，在乳腺癌及BCSCs中，关于miR-7对这些分子的具体调控机制尚未有明确报道。
基于以上研究背景，本研究将关注miR-7与CD44、ESAM及RELA之间的分子调控作用，以期阐明miR-7影响BCSCs亚群的机制，为靶向BCSCs根治乳腺癌提供新的策略。
研究目的
探讨miR-7下调BCSCs亚群比例及抑制BCSCs转移的分子机制，为靶向调控BCSCs治疗乳腺癌提供实验依据。
研究内容与方法
1. MiR-7对人乳腺癌细胞系中的BCSCs亚群及相关分子表达的影响：分别在四种人乳腺癌细胞系中转染miR-7 mimic、miR-7 inhibitor及其相应的对照，通过qPCR、FCM及WB检测各组细胞中BCSCs亚群的比例及相关分子表达水 平的变化。采用瘤内注射miR-7激动剂（miR-7 agomir）治疗BCSCs所致鼠原位瘤，取各组小鼠的肿瘤组织进行检测，进一步确认细胞系中的实验结果。
2. 确定miR-7的调节靶点，探究miR-7下调BCSCs亚群的分子机制：生物信息学手段预测miR-7的作用靶点，构建荧光报告质粒，采用双荧光素酶报告基因实验、ChIP-PCR实验及siRNA干扰实验对分子间的相互作用加以验证。
3. 乳腺癌临床标本中miR-7与相关分子表达关系的检测：收集乳腺癌临床标本及其配对的癌旁组织，提取组织总RNA和蛋白，通过qPCR和WB检测组织中各分子的表达。
4. 人乳腺癌原代细胞的分离培养与鉴定：采用组织块培养法从乳腺癌临床标本中分离并培养人乳腺癌原代细胞，通过qPCR、FCM及WB实验比较新建立的原代细胞与另外三株人乳腺癌细胞系中的 BCSCs 亚群比例及相关分子表达水平。
5. 过表达 miR-7 对 BCSCs 在 NOD/SCID 鼠体内致瘤性的影响：构建过表达miR-7的慢病毒重组体并感染人乳腺癌原代细胞，筛选稳定过表达miR-7的单克隆细胞株并扩大培养，qPCR、FCM及WB检测细胞中的分子表达水平。构建BCSCs所致鼠原位瘤，监测荷瘤鼠的一般状况及肿瘤生长情况，取各组荷瘤鼠的肿瘤、肺、脑等组织进行 qPCR、FCM、WB、IHC 及 IF 等实验检测。
6. 蛋白芯片技术检测BCSCs所致鼠肿瘤组织中的蛋白表达情况：抽提对照组和miR-7 agomir治疗组小鼠的肿瘤组织总蛋白进行蛋白芯片检测，分析实验数据，筛选出感兴趣的差异表达蛋白。
7. 探究miR-7抑制差异表达蛋白ESAM的分子机制：生物信息学手段预测靶点，通过ChIP-PCR、miRNA转染、siRNA干扰实验以及检测乳腺癌临床标本中相关分子表达的情况，验证miR-7对ESAM的调控作用。
8. MiR-7 调控 ESAM 对乳腺癌细胞及 BCSCs 生物学功能的影响：转染 miR-7 mimic和siESAM下调MDA-MB-231细胞中ESAM的表达水平，检测细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移能力的变化。过表达miR-7或下调ESAM治疗BCSCs所致鼠原位瘤，检测肿瘤组织中转移相关分子的改变。
研究结果
1. 在四株人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3及LD细胞中，体外转染miR-7 mimic能显著增加miR-7的表达量，同时有效降低BCSCs亚群比例，并抑制CD44、RELA、EGFR及HAS2等分子的表达；而通过转染miR-7 inhibitor抑制细胞中miR-7的表达量后，BCSCs亚群的比例上调，且以上相关分子的表达水平也增加。此外，相较对照组，miR-7 agomir治疗组肿瘤组织中的BCSCs亚群比例及CD44、RELA等分子的表达水平也受到明显抑制，与细胞系中的实验结果相一致。
2. 利用生物信息学手段预测出miR-7在RELA的3-UTR区有2个潜在靶位点，且RELA在CD44的启动子区存在7个结合位点。双荧光素酶报告基因实验的检测结果显示，在miR-7 mimic和含有RELA 3-UTR区全长的荧光报告质粒的共转染组中，海肾萤光素酶的信号强度显著低于其他各对照组，表明miR-7能靶向RELA的3-UTR区从而抑制RELA的表达。ChIP-PCR实验也证实了RELA可结合至CD44启动子区的-1234~-1243、-1654~-1663及-2073~-2082三个区域，即RELA能直接靶向调控CD44的转录表达。进一步在四株人乳腺癌细胞系中利用siRELA下调RELA后，细胞中CD44的表达水平与对照组相比出现不同程度的下降，证明RELA对CD44存在调控作用。
3. 临床标本的检测结果显示，相较癌旁组织，在乳腺癌患者的癌组织中 miR-7低表达而RELA和CD44高表达，且miR-7的表达水平与后两者间呈负相关，而RELA和CD44两者间的表达水平呈正相关。
4. 从临床乳腺癌手术标本中成功分离、培养并鉴定出一株人乳腺癌原代细胞系，命名为LD细胞。从LD、MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3四株细胞系的检测结果发现，相对高表达miR-7的MCF-7细胞，其RELA和CD44的表达水平及 BCSCs 的比例较低；而在另外三株 miR-7 表达量较低的细胞系中， RELA和CD44的表达水平及BCSCs比例则较高。
5. 在LD细胞中成功筛选出稳定过表达miR-7的单克隆细胞株并扩大培养。体外和体内实验结果显示，通过慢病毒系统过表达miR-7能有效降低LD细胞中RELA和CD44的表达水平，下调LD-CSCs比例并显著抑制其在NOD/SCID鼠体内的致瘤性和肺转移能力。
6. BCSCs所致鼠肿瘤的组织蛋白芯片检测结果显示，相较对照组，miR-7 agomir治疗组的肿瘤组织中有 34 个蛋白分子的表达量下调，21 个蛋白分子表达上调。其中ESAM蛋白的表达水平较对照组降低了3.2倍，qPCR检测结果与蛋白芯片结果近似，显示ESAM表达量下降了约3.6倍。
7. 生物信息学预测结果显示，在ESAM的启动子区存在4个RELA的结合位点。通过ChIP-PCR实验证实了RELA可结合至ESAM启动子区的-1232~ -1243区域，即RELA可直接调控ESAM的转录。MiR-7 mimic转染和siRELA干扰实验以及对乳腺癌临床标本中分子表达的检测结果，进一步验证了 miR-7和RELA对ESAM的调控作用。
8. MDA-MB-231细胞中转染miR-7 mimic或siESAM，均可有效下调ESAM的表达量，同时显著降低细胞的增殖、克隆形成及迁移能力。动物实验结果表明，相较对照组，在过表达miR-7组和ESAM下调组中，BCSCs所致鼠的肿瘤生长缓慢，肿瘤的血管生成及转移显著受到抑制。
结论
MiR-7能显著下调MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3及LD四株人乳腺癌细胞系中的BCSCs亚群，并有效抑制BCSCs在NOD/SCID小鼠体内的致瘤性及转移能力。分子机制研究显示，miR-7通过靶向RELA，间接抑制CD44和ESAM的分子表达，从而减低BCSCs的数量及其干性，抑制肿瘤转移。本研究结果提示，miR-7及RELA、CD44和ESAM可作为靶向BCSCs治疗乳腺癌的有效靶点。