研究背景和目的结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球最常见的癌症之一,在各种恶性肿瘤中发病率和死亡率高居第三位。近年来随着生活水平的提高和饮食习惯及生活方式西方化的转变,结直肠癌的发病率呈上升趋势,且具有发病年龄低、分化程度低、恶性程度高的特点。转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因,多数结直肠患者在初次确诊时就发现明显的转移灶。因此,找到结直肠癌发生、发展及转移的相关机制至关重要。有研究证实连接黏附分子2(Junctional adhesion molecule 2,JAM2)在不同肿瘤中发挥不同的作用,JAM2的表达失调可能参与结直肠癌的侵袭与转移,并且JAM2的异常表达可能受表观遗传学(甲基化)的调控。但是,JAM2与结直肠癌发生发展的关系及其发挥作用的具体分子机制尚未见报道。本课题旨在通过一系列体内外实验,检测结直肠癌中JAM2的表达情况,分析JAM2表达与临床病理参数之间的关系;研究JAM2在结直肠癌发生及进展过程中的作用及具体分子机制;探讨JAM2表达失调的具体调控机制,这一系列结果有望为临床研究治疗结直肠癌提供科学依据。研究方法1)利用GEO公共数据库分析JAM2在结直肠癌及其他恶性肿瘤中的表达情况;分析JAM2在结直肠癌中的表达与患者临床预后之间的关系;2)利用免疫组织化学(IHC)实验检测结直肠癌石蜡组织中JAM2的表达情况;3)构建JAM2稳定过表达的结直肠癌细胞株(SW480/JAM2、HCT116/JAM2)和JAM2稳定干扰的结直肠癌细胞株(RKO-shRNA1、RKO-shRNA2和HCT15-shRNA1、HCT15-shRNA2);通过MTT、平板克隆形成和裸鼠皮下成瘤的实验方法检测JAM2对CRC细胞增殖能力的影响;通过Transwell、划痕愈合实验和三维培养实验研究JAM2对CRC细胞迁移和侵袭能力的影响;4)利用GEO公共数据库,通过GSEA富集分析JAM2低表达或高表达芯片数据中基因的富集情况,查阅相关文献,预测JAM2可能参与的信号通路;5)利用数据库GEO公共数据库检测JAM2 CpG岛甲基化程度,通过亚硫酸氢盐测序实验检测结直肠癌样本中CpG岛的甲基化情况;6)用SPSS20.0统计软件对实验结果进行统计学分析。JAM2在结直肠癌组织及癌旁正常粘膜组织中的表达采用配对样本Wilcoxon符号秩检验;JAM2的表达水平与结直肠癌临床病理特征之间的关系采用卡方检验和Spearman等级相关分析;实时荧光定量PCR、两组间Transwell小室侵袭实验使用两独立样本t检验法。两独立样本t检验需进行Levene方差齐性检验,若方差齐使用方差齐条件下的t检验结果;若方差不齐,则采用Satterthwaite近似t检验。多组间比较采用单向方差分析(ONE-WAY ANOVA);MTT实验、划痕愈合实验及裸鼠皮下成瘤实验采用析因分析设计的方差分析;P<0.05认为有统计学意义。结果1.JAM2在结直肠癌组织中的表达1)公共数据库中JAM2在结直肠癌中的表达情况在GEO数据库中,结直肠癌转录芯片GSE41258显示,JAM2 mRNA表达水平在正常结肠粘膜、肿瘤组织以及肝转移组织中具有显著差异(P<0.001),其在结直肠癌组织和肝转移灶中表达水平显著低于正常肠粘膜组织。Oncomine数据库分析了JAM2 mRNA在不同恶性肿瘤中的表达情况,结果也表明JAM2 mRNA在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤组织中表达水平显著下降。2)结直肠癌组织中JAM2表达水平的检测及其表达水平与患者临床预后的关系IHC结果显示,JAM2在结直肠癌中的表达低于配对的正常肠粘膜组织,且定位于细胞质和细胞膜上,呈黄褐色。Kaplan-Meier法生存分析结果表明,JAM2高表达组结直肠癌患者的5年生存率显著高于JAM2低表达组,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.JAM2在结直肠癌进展中的作用1)JAM2稳定过表达和稳定干扰细胞株的建立利用慢病毒载体构建了JAM2稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株,并采用western blot实验进行了验证。2)JAM2稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞增殖能力的影响MTT实验结果显示,与对照组相比JAM2稳定过表达的细胞生长速度显著下降(P<0.05),JAM2被干扰的细胞株的生长速度显著快于对照组(P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示,与对照组相比JAM2稳定过表达细胞形成的克隆数量显著减少(P<0.05),JAM2被干扰的细胞株形成的克隆数量显著多于对照组(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比JAM2过表达组肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小(P<0.05),并且增殖指数Ki-67的阳性率显著低于对照组(P<0.05);JAM2干扰组肿瘤生长速度较快,肿瘤体积较大(P<0.05);且增殖指数Ki-67的阳性率显著高于对照组(P<0.05)。3)JAM2稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞迁移侵袭能力的影响划痕实验结果显示,与对照组相比稳定过表达JAM2的细胞株迁移速度明显减慢;而JAM2干扰细胞株细胞迁移的速度则显著快于对照组。Transwell细胞迁移实验结果显示,与对照组相比稳定过表达JAM2的细胞株迁移细胞的数量明显减少(P<0.05);而JAM2被干扰的细胞株迁移细胞的数量则显著多于对照组(P<0.05)。三维培养实验结果显示与对照组相比,稳定过表达JAM2的细胞株向周围基质中浸润的突起明显减少;而JAM2干扰细胞株向周围基质中浸润的突起显著多于对照组(P<0.05)。3.JAM2在结直肠癌进展过程中的作用机制GSEA基因富集分析结果显示,在基因芯片GSE13067数据中,NF-κB、MAPK等信号通路在JAM2低表达的结直肠癌中出现明显上调,并且通路相关基因显著富集(P<0.05).4.结直肠癌中JAM2的上游调控机制1)数据库分析结直肠癌组织JAM2启动子CpG岛的甲基化程度我们利用GEO数据库中的结直肠癌配对组织的甲基化芯片数据GSE17648进行了JAM2启动子CpG岛的甲基化程度分析,结果显示结直肠癌组织中JAM2 CpG岛的甲基化程度显著高于正常结肠粘膜组织(P<0.05)。我们还利用了大样本非配对结直肠癌组织甲基化芯片数据GSE25062和GSE40055对JAM2启动子CpG岛的甲基化程度进行了进一步的分析,结果显示,结直肠癌组织中JAM2 CpG岛的甲基化程度明天高于正常肠粘膜组织。2)5-Aza-CdR处理结直肠癌细胞后JAM2表达情况的变化Western blot实验结果显示,采用去甲基化药物5-Aza-CdR处理结直肠癌细胞后,JAM2的表达水平随着药物浓度的增加而逐渐升高,并且呈浓度依赖关系。3)结直肠癌组织中JAM2 CpG岛甲基化程度的检测BSP实验结果显示,5例正常肠粘膜组织中JAM2 CpG岛的甲基化程度分别为36.6%、34.3%、38.0%、35.6%、38.4%,而在相对应的结直肠癌组织中JAM2 CpG的甲基化程度则分别为47.7%、50.5%、40.7%、63.0%45.8%,肿瘤组织中的JAM2 CpG岛的甲基化程度显著高于正常肠粘膜组织。结论1、JAM2在结直肠癌组织中表达低于癌旁组织,在结直肠癌细胞中表达低于正常肠上皮细胞;2、JAM2可能通过调节MAPK、NF-κB信号通路,调节结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移;3、JAM2的表达受CpG岛甲基化调控,JAM2 CpG岛高甲基化是其表达下降的主要因素。