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目的建立MSCV-FOXP3转导法和TGF-β诱导法获取调节性T淋巴细胞(regulatory T cells, Treg)样细胞的方法体系,比较两种方法获得Treg样细胞的产率及其免疫抑制功能的差异,并初步探讨两种Treg样细胞发挥免疫抑制作用相关机制的差异。方法1.构建重组逆转录病毒质粒pMSCV-FOXP3,转染PT67细胞,建立可稳定产毒单克隆细胞株；采用差速离心法对病毒进行浓缩。2.免疫磁珠分选法获取CD4+CD25-T淋巴细胞；以CD4+CD25-T淋巴细胞为研究对象,采用优化后实验方法进行MSCV-FOXP3转导和TGF-β诱导获取Treg样细胞,以流式细胞术和Real time PCR技术对两种方法获得Treg样细胞的效率进行检测和比较。3.应用活性染料CFSE染色和流式细胞术观察两种Treg样细胞和天然Treg细胞对自体CD4+T淋巴细胞增殖活性的影响,用ModFit软件分析CD4+T淋巴细胞增殖动力学模型。4.应用ELISA技术,检测两种Treg样细胞培养上清IL-10和TGF-β的分泌水平；应用Real time PCR技术检测两种Treg样细胞颗粒酶A和颗粒酶B mRNA的转录水平差异。结果1.成功构建pMSCV-FOXP3重组质粒,转染PT67细胞,筛选建立了稳定产毒单克隆细胞株,最高病毒滴度为6×105cfu/ml。浓缩后病毒滴度可达1.2×107cfu／ml。2.免疫磁珠分离获得CD4+CD25-T淋巴细胞,流式细胞术检测其纯度为92.46%,CD4+CD25+T淋巴细胞纯度为90.82%,台盼蓝染色检测细胞存活率高于90%。当病毒滴度为1×107cfu/ml时,诱导获得的Treg样细胞产率最高,可达49.12%；当TGF-β为5ng/ml,诱导时间为第6天时,诱导获得的Treg样细胞产率最高,可达41.08%；MSCV-FOXP3转导组CD4+T淋巴细胞的FOXP3 mRNA表达水平高于TGF-β组(P<0.05),MSCV-FOXP3转导组CD4+T淋巴细胞的FOXP3蛋白阳性率高于TGF-β组(P<0.05)。3.流式细胞术检测结果显示,MSCV-FOXP3转导CD4+T淋巴细胞获得的Treg样细胞、TGF-β诱导获得的Treg样细胞以及天然型Treg细胞对自体CD4+T淋巴细胞的增殖均具有明显抑制作用,与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)。4.MSCV-FOXP3转导CD4+T淋巴细胞获得的Treg样细胞与TGF-β诱导获得的Treg样细胞分泌IL-10水平明显上升,与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)。TGF-β诱导组和MSCV-FOXP3转导组TGF-β分泌水平较对照组无明显差异(P>0.05)。颗粒酶B在TGF-β诱导获得Treg样细胞表达水平较对照组明显升高(P<0.05)。颗粒酶B在TGF-β诱导获得Treg样细胞表达水平较显著高于MSCV-FOXP3转导组(P<0.05)。结论MSCV-FOXP3转导法和TGF-β诱导法均可在体外获得具有一定免疫抑制功能的Treg样细胞,但MSCV-FOXP3转导法的Treg样细胞产率要高于TGF-β诱导法,其获得的Treg样细胞免疫抑制活性可能高于TGF-β诱导法。在两种Treg样细胞发挥免疫抑制功能的过程中,IL-10可能均参与其中,而颗粒酶B可能只参与了TGF-β诱导的Treg样细胞发挥免疫抑制功能的过程。