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目的：近年来血管组织工程已成为极具临床应用前景的研究热点。但目前血管组织工程尚处在初步阶段,在支架材料的选择、细胞种植方式、血管体外培育以及移植后通畅率等方面仍然存在许多有待解决的问题。正常血管壁从管腔面向外依次分为内膜、中膜和外膜。内膜主要由内皮细胞组成,内皮细胞的存在可以提高移植物抗血栓能力、释放活性因子控制平滑肌细胞的漂移和增殖,为血管组织工程必须的种子细胞。平滑肌作为主要的中膜细胞,可以调节血管舒缩,参与合成胞外基质等。研究表明,在组织工程血管构建中,内皮细胞和平滑肌细胞的相互调节是稳定血管壁结构的关键。胶原是构成血管壁的主要胞外基质成分,能为种植细胞提供良好的生长、增殖和分化微环境。本实验尝试从新鲜脐带中分别分离出脐静脉内皮细胞(HUVECs)和脐动脉血管平滑肌细胞(hSMCs),以鼠尾Ⅰ型胶原作为体外细胞共培养支架,采用胶原浮胶共培养的方法探索hSMCs对HUVECs血管样结构形成能力及相关基因表达的影响。
方法：无菌条件下取新鲜脐带,以0.1％胶原酶A灌注法分离脐静脉内皮细胞,以组织块培养法分离脐动脉平滑肌细胞;根据细胞形态和特异性标记物免疫荧光染色对细胞进行鉴定。采用浓度为1.5 mg/ml鼠尾Ⅰ型胶原制备胶原浮胶细胞共培养体系,即单层HUVECs种植于浮胶底面,单层hSMCs种植在与浮胶相对的培养板表面,加入适量培养液使胶原凝胶处于悬浮状态,MTS法分析共培养和单独培养中细胞的增殖情况,利用倒置相差光镜观察细胞形态结构,扫描电镜观察内皮细胞在胶原表面的生长情况及胶原表面结构形态。RT-PCR和激光共聚焦免疫荧光显微镜技术分析内皮细胞基因表达和管腔样结构形成。
结果：由新鲜脐带分离的HUVECs具有典型的铺路石样形态,CD31染色阳性;由新鲜脐带分离的hSMCs具有较强的增殖力,形态均一,细胞α-SMA染色呈阳性,人胚胎肾细胞作为阴性对照无此现象。MTS检测表明,共同培养的细胞增殖水平从第二天的0.2777+0.0631降至第四天的0.0569±0.0049,此后细胞增殖维持在较低水平,第四天开始,共同培养的细胞增殖水平均低于内皮细胞和平滑肌细胞单独培养组。在胶原浮胶细胞共培养体系中,种植于胶原表面的HUVECs培养后18 h大部分失去典型的铺路石样形态,出现胞质伸展,细胞整体拉长的结构特征,24 h后出现由内皮细胞围成的管腔样结构,而种植在细胞培养板上的内皮细胞则未形成管腔样结构。种植有内皮细胞的胶原支架表面结构改变,胶原纤维重塑。
共聚焦免疫荧光观察表明,胶原浮胶细胞共培养中的内皮细胞能够形成更丰富的管腔样结构,其管腔样结构密度在第3天高于对照组62％,第5天121％,第7天163％;实验组内,管腔样结构密度随培养时间延长而逐渐增加,且具有统计学意义(P＜0.05)。实验组中的管腔平均面积和管壁平均面积均明显高于对照组(P＜0.01),但实验组内,管腔平均面积和管壁平均面积在时间上无明显变化(P＞0.05)。
RT-PCR分析表明,在胶原浮胶细胞共培养体系中,血管内皮细胞的血栓调节蛋白(TM)、基质金属酶蛋白MMP-9和MMP-1的基因表达水平显著高于内皮细胞单独培养组,层粘蛋白γ2和组织因子途径抑制物(TFPI-2)的基因表达量在两组间未见显著差异。共聚焦免疫荧光蛋白质表达水平分析表明,共培养体系中内皮细胞TM表达量明显高于单独培养组,在第24、48小时分别是对照组表达水平的1.6倍(P＜0.05)和2.5倍(P＜0.01)。
结论：HUVECs和hSMCs是体外研究和构建血管组织工程的理想细胞来源,采集方便,培养成功率高。Ⅰ型胶原作为胞外基质的主要成份,十分适合用来做血管组织工程支架材料。我们所建立的胶原浮胶细胞共培养体系是研究细胞间相互作用的较理想模型,可以十分便利的观察不同类型细胞的形态特征,方便采集不同细胞实验数据。在我们的实验模型中,平滑肌细胞共培养,可影响内皮细胞血管形成相关基因的表达,更有利于网络状管腔样结构的形成。可见共培养体系中的细胞.细胞、细胞-胞外基质间的相互影响对维持内皮细胞正常生理功能和提高管腔形成能力有重要意义。