【摘 要】
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小花棘豆（Oxytropis glabra）是一种含有毒生物碱—苦马豆素（swainsonine,SW）的植物,其内生真菌产SW,导致宿主植物中SW积累表现出毒性,课题组从小花棘豆中分离了产SW的内生真菌Alternaria oxytropis。前人研究发现产SW内生真菌还有豆类丝核菌（Slafractonia leguminicola）、罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“基于转录组学的小花棘豆内生真菌苦马豆素合成相关基因的筛选和功能研究”（项目编号:31960130）和“小花棘豆 Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因在苦马豆素代谢中的作用”（项目编号:31460235）；
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小花棘豆（Oxytropis glabra）是一种含有毒生物碱—苦马豆素（swainsonine,SW）的植物,其内生真菌产SW,导致宿主植物中SW积累表现出毒性,课题组从小花棘豆中分离了产SW的内生真菌Alternaria oxytropis。前人研究发现产SW内生真菌还有豆类丝核菌（Slafractonia leguminicola）、罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）等。在真菌的SW合成途径研究中,发现有一个共同的SWN基因簇,其中swn K是一个关键基因,推测其编码一个多功能蛋白,含七个结构域:A结构域进行腺苷酰化、T结构域进行硫醇化、KS结构域编码酮基合酶、AT结构域编码酰基转移酶、KR结构域编码聚酮还原酶、ACP结构域编码酰基载体蛋白、R结构域编码还原酶,经多步反应,催化哌啶酸生成1-羟基-吲哚里西啶。本研究利用PCR技术克隆SW合成途径中关键基因swn K及其启动子区,进行生物信息学分析,构建swn K基因ACP结构域和R结构域的敲除载体,将其转化A.oxytropis OW7.8原生质体,筛选基因敲除转化子,并检测其SW水平,为明晰A.oxytropis的SW合成分子机制及代谢途径提供基础数据,结果如下:1.克隆了A.oxytropis OW7.8 swn K基因,从ATG-TAA共有7515bp,无内含子,编码2504个氨基酸,含7个结构域:A结构域168bp-1578bp（腺苷酰化作用）;T结构域1647bp-1833bp（磷酸泛酰巯基乙胺连接物位点）;AT/KS结构域1899bp-4557bp（聚酮合酶）;KR结构域4599bp-5961bp（β-酮酰还原酶）;ACP结构域6024bp-6270bp（磷酸泛酰巯基乙胺连接物位点）;R结构域6453bp-7338bp（α-氨基己二酸还原酶Lys2和NRPSs的硫酯还原酶结构域）。2.克隆了swn K基因上游调控区,包括启动子、增强子、光响应元件、缺氧特异性诱导元件,其中-52bp至-57bp为TATA-box、-81bp至-85bp为CAAT box、-158bp至-163bp为G-box、-186bp至-191bp为CCAAT-box等,共计有1个TATA-box、4个CAAT-box、1个G-box。3.构建了swn K基因ACP结构域敲除载体（5568bp）和R结构域敲除载体（5224bp）,含其结构域上游DNA同源区序列+hph+下游DNA同源区序列、ampr,是大肠杆菌-丝状真菌的穿梭载体;构建了swn K基因R结构域编辑载体（16510bp）,含靶位点、ampr、hph、gpd A启动子、trp C终止子,也是大肠杆菌-丝状真菌的穿梭载体。4.利用PEG介导,将swn K基因敲除载体转化A.oxytropis OW7.8原生质体,筛选出swn K基因ACP结构域敲除突变株ΔACP1和ΔACP2,培养20d的ΔACP1和ΔACP2菌丝体中未测出SW,相同条件下培养的野生型菌株OW7.8菌丝中SW水平为5.072mg/g。推测Swn K失去ACP结构域功能后,底物Malonyl-Co A无法结合,Malonyl-Co A与哌啶酸不能缩合生成1-羟基-吲哚里西啶,后续SW则无法合成,故敲除株中不含SW。5.敲除株ΔACP1和ΔACP2菌落形态与野生型有所不同,表现为菌落形状不规则、边缘非整齐、呈乳白色、辐射状生长、背面无色素积累。
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