研究背景:坏死亲和性化合物是一类能够利用生物体内坏死组织暴露的大量靶点,特异性地与其结合并浓聚于坏死组织的物质。通过特异性靶向坏死组织,坏死亲和性化合物已被用于坏死相关疾病的诊断和检测,如心肌梗死范围的精确定量、组织活性的评价、肿瘤治疗后的疗效评估等。此外,坏死亲和性化合物标记上放射性核素在实体肿瘤的治疗方面也展现出巨大的潜力。众多坏死亲和性化合物中,金丝桃素及其放射性标记物的研究最为广泛。然而,由于金丝桃素水溶性差、易自聚以及光毒性等缺陷,一定程度上限制了其发展和临床转化。因此,寻找一种药代动力学分布好、生物安全性高的坏死亲和性化合物成为新的研究方向。伊文思蓝(Evans Blue,EB),是一种人工合成的双偶氮类染料,其作为生物染料和诊断剂已有很悠久的历史。由于其白蛋白结合特性及荧光特性,EB已被广泛应用于生物医学中,包括孕妇和婴幼儿的血容量测定。近期有研究发现EB和油红-碘油溶液(RIO)的多重染色可用于风险心肌中梗死心肌的识别,表明EB可能具有坏死亲和特性。此外,由于EB的结构易折断和易螯合,基于EB和EB衍生物合成的大量示踪剂已应用于临床当中。因此,探究EB的坏死亲和特性及其靶向坏死的机制有利于开发EB的新用途,EB的生物安全性及其多模态成像表明其在临床转化方面具有巨大的潜能。研究目的:本文拟从活体、组织和细胞层面探究EB及放射性标记的EB示踪剂(131I-EB)的坏死亲和特性,并阐述其靶向坏死的机制。研究方法:1.通过建立大鼠再灌注部分肝梗死模型、兔VX2肿瘤自发性坏死模型和斑马鱼肌肉坏死模型等多种动物坏死模型,静脉注射EB溶液后荧光成像探究EB靶向坏死组织的分布情况。2.采用Iodogen氧化法制备131I-EB,利用SPECT成像、荧光成像、伽马计数和放射自显影等技术在大鼠再灌注部分肝梗死模型上探究其生物学分布和坏死亲和特性。3.诱导组织和细胞坏死,通过孵育结合血清白蛋白的EB溶液后荧光成像,从组织层面和细胞层面探究EB的坏死亲和特性。4.通过坏死细胞孵育EB溶液后共聚焦拍照,探究EB的细胞内定位;利用光谱学实验研究EB与DNA或蛋白质之间的相互作用;通过蛋白电泳和质谱分析探究EB与靶向蛋白的结合情况。研究结果:1.成功建立大鼠再灌注部分肝梗死模型、兔VX2肿瘤自发性坏死模型和斑马鱼肌肉坏死模型等多种动物坏死模型,静脉注射EB溶液24 h后,EB能够选择性积聚在坏死的肝脏组织、坏死的肿瘤组织和坏死的肌纤维中,与正常组织的摄取差异具有统计学意义。2.采用Iodogen氧化法成功制备131I-EB,标记率高达97%。SPECT成像可见坏死肝脏区域放射性摄取逐渐浓聚,伽马计数、放射自显影和体外荧光成像均显示坏死肝脏和正常肝脏之间131I-EB的摄取差异具有统计学意义。3.组织和细胞孵育EB溶液后荧光成像显示坏死肝脏组织可见红色荧光,正常肝脏组织未见红色荧光;坏死细胞显示出强烈的红色荧光,存活细胞几乎未见红色荧光。4.共聚焦拍照显示红色荧光主要位于坏死细胞的细胞核内,核仁最强;光谱学实验显示EB不会与DNA结合,而与蛋白质发生相互作用;蛋白电泳和质谱分析显示坏死组织和坏死细胞中EB结合的蛋白质主要是白蛋白。结论:1.建立大鼠再灌注部分肝梗死模型、兔VX2肿瘤自发性坏死模型和斑马鱼肌肉坏死模型等多种动物坏死模型可作为坏死亲和性化合物研究的基础平台。2.本研究从活体、组织和细胞三个层面均证实了EB具有坏死亲和特性,靶向坏死的机制与坏死细胞内暴露的DNA无关,与暴露的大量蛋白质结合相关。3.Iodogen氧化法制备131I-EB的标记过程简单有效,标记率高。研究表明131I-EB同EB一样具有坏死亲和特性,作为一种多模态的坏死靶向探针在坏死靶向成像和实体肿瘤治疗方面具有广阔前景。