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桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶,是我国传统中药,也是国家卫健委规定的食药两用资源之一。自古以来桑叶就有用于治疗糖尿病,唐《食疗本草》中记载:“桑叶炙煎饮之,止渴,一如茶法”,明《本草纲目》载:“桑叶乃手足阳明之药,汁煎代茗,能止消渴”（消渴即现代糖尿病）。现代研究表明,其治疗糖尿病的主要活性成分是以1-脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin,DNJ）为主的多羟基生物碱类成分。DNJ生物碱作为强效α-糖苷酶抑制剂可有效抑制血糖的升高,降脂以减轻动脉粥样硬化,抗艾滋病毒感染等,其独特的化学结构和显著的药理活性,在开发治疗糖尿病新药及功能性食品方面显示出巨大的潜力。但桑叶中DNJ生物碱含量较低、提取分离困难,化学合成及微生物转化的方法存在路线复杂、异构体分离难度大、产率低等问题,因此寻找获得DNJ生物碱的有效新途径成为当前迫切希望解决的问题。而通过解析活性成分生物合成途径,利用合成生物学策略有望成为一种资源获取的新方法,但DNJ生物碱生物合成途径尚未完全解析。课题组前期已经研究了桑叶中DNJ生物碱的上游生物合成途径,揭示了其从赖氨酸到哌啶的生物合成途径,但从哌啶到DNJ的关键甲基化和羟基化过程尚不清楚。本研究通过比较转录组学筛选桑叶DNJ生物碱生物合成甲基转移酶和CYP450羟化酶候选基因,对甲基转移酶候选基因进行了克隆、表达和体内外功能研究,初步解析了DNJ生物碱生物合成的关键甲基化过程;并对部分CYP450羟化酶候选基因进行了克隆和表达。本研究结果将为完整解析DNJ生物碱生物合成途径奠定基础,同时也为最终实现合成生物学生产DNJ生物碱,进而缓解其资源短缺问题提供依据。主要研究内容和结果如下:1.桑叶DNJ生物碱生物合成相关甲基转移酶及CYP450羟化酶基因的挖掘通过进一步挖掘桑叶转录组数据（SRA登录号:SR127713）结合KEGG代谢通路分析等,初步筛选得到涉及DNJ生物碱生物合成甲基化过程相关的甲基转移酶差异基因9个,羟基化过程相关的CYP450羟化酶差异基因17个;分析不同生长时期（7月5日-10月25日）桑叶中差异基因的表达水平与DNJ含量变化的相关性,结果显示3个甲基转移酶基因c34262＿g1,c41333＿g1和c28557＿g1和8个CYP450羟化酶基因c11320＿g1,c29832＿g1,c36193＿g1,c29603＿g1,c39525＿g1,c42177＿g1,c82195＿g1,c46601＿g1的表达水平分别与DNJ含量变化显著相关（P＜0.05）,推测其为桑叶DNJ生物碱生物合成甲基转移酶候选基因和CYP450羟化酶候选基因。2.桑叶DNJ生物碱生物合成甲基转移酶候选基因的克隆及原核表达首次从桑叶中克隆得到DNJ生物碱生物合成甲基转移酶候选基因MaMT1（Gen Bank登录号:OM140666）,MaMT2（Gen Bank登录号:ON152713）和MaMT3（Gen Bank登录号:OM140667）。生物信息学分析结果显示MaMT1,MaMT2和MaMT3分别注释为丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）,甾醇-C-24-甲基转移酶（SMT）和酮泛解酸羟甲基转移酶（KPHMT）家族,其氨基酸序列包含对应家族的保守结构域。构建的系统发育树显示MaMT1与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的SHMT亲缘关系较近,而MaMT2和MaMT3分别与川桑Morus notabilis的SMT和KPHMT亲缘关系较近。采用双酶切和T4连接法构建了三个基因的原核表达载体MaMT1/p ET30a,MaMT2/p ET30a和MaMT3/p ET30a,并成功在大肠杆菌DE3中诱导表达,诱导条件为IPTG终浓度为0.2 mmol/L,15℃条件下培养16 h。三条重组蛋白均以包涵体的形式存在,通过变性、His标签纯化及透析复性后,获得纯化的MaMT1,MaMT2和MaMT3重组蛋白,分子量分别为38.0 k Da,39.6 k Da和35.5k Da。3.桑叶DNJ生物碱生物合成甲基转移酶候选基因的体外功能研究采用酶促反应研究了MaMT1、MaMT2和MaMT3蛋白的体外催化功能,结果显示MaMT1蛋白以哌啶为底物、S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）为甲基供体能催化哌啶形成2-甲基哌啶,而MaMT2和MaMT3未能催化哌啶形成2-甲基哌啶;分子对接进一步验证了MaMT1蛋白与哌啶、SAM有较好的相互作用,而MaMT2、MaMT3与哌啶、SAM之间无相互作用。并以哌啶为底物、羟甲基为供体研究发现MaMT1蛋白不能催化哌啶形成羟甲基哌啶,以上结果表明MaMT1具有体外催化哌啶形成2-甲基哌啶的功能,而不具有体外催化哌啶形成2-羟甲基哌啶的功能;不同生长季节桑叶中MaMT1基因表达水平与DNJ含量变化相关性分析结果显示,两者呈显著正相关（P＜0.05）,表明MaMT1基因可能是桑叶DNJ生物碱生物合成途径中哌啶甲基化形成2-甲基哌啶过程的关键酶基因。研究了MaMT1蛋白的底物特异性,结果显示MaMT1无法催化Δ~1-哌啶烯和4-羟基哌啶发生甲基化反应。而MaMT1可催化3-羟基哌啶甲基化产生一个新的物质,质谱数据库相似度比对为3-羟基-N-甲基哌啶,但DNJ在N位无–CH3,表明3-羟基哌啶为底物时,不能合成DNJ,而3-羟基-N-甲基哌啶可能是合成DNJ衍生物N-甲基-DNJ的中间体,本结果可为DNJ生物碱其它衍生物的合成途径解析提供参考。4.桑叶DNJ生物碱生物合成关键MaMT1基因的体内功能研究利用桑的VIGS转化体系,通过基因沉默实验验证了关键MaMT1基因对桑叶体内DNJ生物碱生物合成的调控作用。采用酶切和T4连接法构建重组病毒载体V-MaMT1/p TRV2并转化至农杆菌GV3101,利用真空渗透法侵染桑的无菌苗,培养后经PCR鉴定获得阳性MaMT1基因沉默桑叶。分析VIGS桑叶与对照组桑叶中MaMT1基因表达水平和DNJ含量,结果显示实验组桑叶中MaMT1基因表达水平显著降低（P＜0.001）,平均沉默效率为80.7%;实验组与对照组桑叶中DNJ平均含量分别为0.16 mg/g和0.27 mg/g,降低率为42.1%,表明当MaMT1基因被沉默后,会显著降低桑叶中DNJ生物碱的积累（P＜0.01）,说明MaMT1基因参与了DNJ生物碱的生物合成。5.桑叶DNJ生物碱生物合成CYP450羟化酶候选基因的克隆及真核表达首次从桑叶中克隆得到5个CYP450羟化酶基因Ma P450-A1（Gen Bank登录号:ON152708）,Ma P450-A2（Gen Bank登录号:ON152709）,Ma P450-A3（Gen Bank登录号:ON152710）,Ma P450-A4（Gen Bank登录号:ON152711）和Ma P450-A5（Gen Bank登录号:ON152712）,分别归为P450 71A1、P450 724B1、P450 77A1、P450 89A2和P450 734A1亚家族。多重序列比对表明Ma P450s蛋白均包含CYP450酶家族保守结构域FGx Gxxx Cx G,Exx R和（A/G）Gx（D/E）T。系统进化树结果显示5个CYP450羟化酶候选基因属于CYP450酶不同的亚家族,分别聚为一类,且5个酶基因均与川桑Morus notabilis中对应的CYP450亚家族酶基因亲缘关系较近。利用双酶切和T4连接法分别构建Ma P450s/p ESC-TRP真核表达载体,并转化到酿酒酵母WAT11菌株中,利用半乳糖法诱导蛋白表达,并提取获得Ma P450-A1/A2/A3/A4/A5微粒体蛋白,为后续桑叶中DNJ生物碱生物合成羟基化过程解析奠定基础。综上,本文基于桑叶转录组数据筛选克隆及异源表达了甲基转移酶候选基因,且进行了体内外功能验证,初步阐明了桑叶中DNJ生物碱生物合成途径中从哌啶到2-甲基哌啶的关键甲基化过程,并筛选克隆及异源表达了其羟基化过程相关的CYP450羟化酶候选基因,为后续桑叶DNJ生物碱生物合成途径的完整解析奠定基础。